text.skipToContent text.skipToNavigation

Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit

中等规模自动化纯化His-tagged蛋白

  • 每个孔可全自动纯化得到至多10 mg蛋白
  • 可得到高纯度蛋白,无交叉污染
  • 可在天然条件或变性条件下纯化

Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit能够从96个平行样本中自动化纯化至多600 µg重组蛋白(标准化的实验方案,每个样本5 ml培养体积)。澄清的细菌细胞裂解液与Ni-NTA Superflow流到过滤平台上,用BioRobot工作站处理。独特的96孔金属螯合亲和层析模块能够紧密的选择结合His-tagged蛋白。即用型的实验方案能够在天然或者变性的条件下纯化蛋白质。

Cat No./ID: 969261
Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit (4)
For 4 x 96 6xHis-tagged protein preps: 4 QIAfilter 96 Plates, 4 TurboFilter 96 Plates, 1 x 100 ml Ni-NTA Superflow

Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


1
Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit.
2
自动进行表达克隆筛选。
中等规模纯化用于表达克隆筛选和蛋白质分析。将表达12、15和28 kDa以及48/50 kDa异源二聚体蛋白的载体的混合物转入E. coli,接种入选择培养基中,随机挑选96个克隆接种到5 ml培养基中。IPTG诱导过夜,6xHis-tagged蛋白表达。收集细胞并裂解,纯化6xHis-tagged蛋白。每个洗脱部分中取5 µl进行SDS-PAGE分析;考马斯亮蓝染色观察蛋白。
3
每孔的纯His-tagged蛋白的毫克量。
将表达His-tagged蛋白的载体转入E. coli,接种入选择培养基中,挑选的克隆接种到25 ml培养基中。IPTG诱导2–4h,6xHis-tagged蛋白表达。收集细胞放入24孔板中,在BioRobot 3000上每孔用200 µl Ni-NTA Superflow 树脂处理。从第一次的洗脱液中取5 µl(0.9%)上样进行SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色观察蛋白。G:绿色荧光蛋白(kDa);T:T7 RNA多聚酶(100 kDa);S: E. coli GroES(12 kDa)。一些内源性的GroEL被共纯化;C:E. coli氯霉素乙酰转移酶(28 kDa);L:E. coli GroEL(60 kDa);α:人肿瘤坏死因子α(18 kDa);E:纯化的E. coli GroES 作为共过表达非标记的GroEL(12和60 kDa)的复合物;10:Saccharomyces cerevisiae Cpn-10(10 kDa)。M:分子量标准。
Performance

根据客户对大量自动纯化蛋白质的需求,QIAGEN调整了Ni-NTA Superflow 96 BioRobot的实验方案,以处理更大的培养体积,每孔可纯化毫克级的His-tagged蛋白。每孔Ni-NTA Superflow树脂的量增加到200 µl,优化的裂解缓冲液配方能够处理至多25 ml(天然条件下纯化)或者15 ml(变性条件下纯化)培养液(高产的实验方案)。细胞培养液转移到24孔板中处理。每孔可纯化多达10 mg的His-tagged蛋白(取决于蛋白表达水平)(参见"Milligram amounts of His-tagged proteins per well"),同一批次的蛋白质可用于多次检测,减少制备蛋白的次数(参见"Automated expression clone screening")。一步法纯化提供了高产量的高纯度蛋白质,并且可实现大蛋白复合物纯化。

采用经调整的Ni-NTA Superflow 96 BioRobot实验方案得到His-tagged蛋白的产量
His-tagged蛋白 每孔总产量(µg)* 蛋白质浓度(mg/ml)†
绿色荧光蛋白 4000 6.0
T7 RNA聚合酶 1000 1.4
GroES 300 0.4
Chloramphenicol acetyltransferase 2400 4.4
GroEL 740 1.0
Tumor necrosis factor α 1600 2.5
GroES/GroEL 1200 1.5
Cpn-10 170 0.3
* 在两个550 µl洗脱组分中(平均6个独立的纯化过程)获得的产量。80%的蛋白质洗脱在第一个550 µl体洗脱组分中。 
† 蛋白质集中在第一个550 µl洗脱组分中。
Principle

QIAexpress Ni-NTA Protein Purification System,包括Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit,原理是基于著名专利技术Ni-NTA(镍-次氮基三乙酸)树脂,用于纯化带有6个或者以上组氨酸残基His标签的蛋白质。该技术能够在天然或者变性的条件下,从各种表达体系中一步法纯化大多数His-tagged蛋白。NTA有4个镍离子的螯合位,相比金属-螯合纯化系统只有3个与金属离子相互作用的位点,能够更紧密地与镍结合。额外的螯合位点防止镍离子浸出,从而拥有更强的结合能力,并且相比于其他金属-螯合纯化系统,该系统能制备更高纯度的蛋白质。QIAexpress体系可以从任何的表达体系中,包括杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌,纯化His-tagged蛋白。(参见"Protein purification with the Ni-NTA protein purification system")。

Procedure
Ni-NTA Superflow BioRobot Kit的纯化过程包括4个步骤:细胞裂解、蛋白结合、洗涤和洗脱(参见"Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit")。利用QIAexpress 系统纯化重组蛋白并不取决于蛋白或者6xHis标签的三维空间结构。这一特性能够在天然或变性条件下,一步从稀释溶液或者粗裂解物中纯化蛋白。强变性剂和清洁剂可以有效的溶解和纯化受体、膜蛋白和形成包涵体蛋白。这些试剂能够高效地去除非特异性结合的污染物,可以包含在洗涤缓冲液中(参见下表)。在温和的条件下,加入100–250 mM咪唑作为竞争物或者降低pH值洗脱纯化的蛋白质。

Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit需配合BioRobot 3000、8000或者9600工作站使用。

与His/Ni-NTA相互作用的试剂
变性剂 清洁剂 还原剂 其他 盐  长期储存 
6 M Gu·HCl 2% Triton X-100 20 mM β-ME 50%甘油 4 M MgCl2 至多30%乙醇
8 M尿素 2% Tween 20 10 mM DTT 20%乙醇 5 mM CaCl2 或者100 mM NaOH
  1% CHAPS 20 mM TCEP 20 mM咪唑 2 M NaCl  
Applications

QIAexpress Ni-NTA Protein Purification System可有效的一步纯化蛋白质,纯化的蛋白适用于各种应用,包括:

  • 结构和功能研究
  • 蛋白结晶用于三维结构分析
  • 蛋白与蛋白,蛋白与DNA 相互作用研究
  • 抗体制备
Features
Specifications
应用 Proteomics
磁珠大小 60–160 µm
结合能力 5–20 mg/ml
每次制备的数量 1–96 samples per run
处理 Automated
规格 Medium scale
特性 Cross-contamination-free
起始材料 Cell lysate
支持/基质 Superflow
标签 6xHis tag
产量 15 µg – 4 mg

您无权限查看此资源

试剂盒操作手册 (2)
补充实验方案 (2)
The two protocols given below are for the use of the Ni-NTA Superflow 96 BioRobot® Kit in manual procedures. The kit has been specially designed and optimized for automated 6xHis-tagged protein purification on QIAGEN® BioRobot Systems. For more details of the advantages of BioRobot Systems see the Ni-NTA Superflow 96 BioRobot Kit Handbook supplied with the kit or contact one of the QIAGEN Technical Service Departments or local distributors listed on the last page of the handbook.
显示更多
The following protocols have been designed for the use of Ni-NTA Superflow Columns on the QIAvac 6S vacuum manifold or in gravity-flow applications on the QIArack. Up to 15 mg 6xHistagged protein can be purified per column from cleared lysate derived from up to 1 liter of (E. coli) bacterial culture.
显示更多
fragment fix placeholder