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REPLI-g Single Cell Kit

对单个细胞或有限的样本进行高度均一的全基因组扩增(WGA)
  • 采用多重置换扩增技术对基因组位点进行无偏差的扩增
  • 适用于二代测序等新技术应用
  • 产量稳定,可达40 µg(产物平均长度大于>10 kb)
  • 可用于癌症、干细胞或宏观基因组学(metagenomics)研究

很多研究人员使用二代测序仪器对生物样本的DNA序列进行分析和基因分型,但经常受限于有限的样本量。REPLI-g Single Cell Kit可均一的扩增单个细胞(1至1000个细菌或肿瘤细胞)或纯化的基因组DNA,能够覆盖基因组所有位点。另有专用于干血或新鲜或冷冻的组织样本的实验方案。所有缓冲液和试剂生产都经过严格控制的流程,避免污染DNA,确保每次实验获得可靠的结果。该产品采用多重置换扩增(MDA)技术,对所有基因组位点进行无偏差的扩增。与基于PCR的全基因组扩增技术相比,该技术具有更好的扩增高保真度,避免出现假阳性或假阴性信号。

Cat No./ID: 150343
REPLI-g Single Cell Kit (24)
REPLI-g sc Polymerase, Buffers, and Reagents for 24 whole genome amplification reactions (yields up to 40 µg/reaction)
Cat No./ID: 150345
REPLI-g Single Cell Kit (96)
REPLI-g sc Polymerase, Buffers, and Reagents for 96 whole genome amplification reactions (yields up to 40 µg/reaction)

REPLI-g Single Cell Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0

Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation.

Genomic DNA samples (10 ng) were denatured using heat (95°C) or the standard REPLI-g Kit alkaline lysis protocol. After amplification using Phi 29 polymerase, the CT values of 2 loci were compared between samples. The low CT values of loci amplified using the REPLI-g Kit alkaline lysis protocol indicate better locus representation, meaning there has been no loss of sequence information at these loci.
1

Consistent long-term stability.

Real-time PCR of REPLI-g amplified DNA samples stored in 4 different formats at –20°C for the indicated time periods. Two loci, [A] locus A and [B] locus B, were assayed for each sample. gDNA: genomic DNA not amplified with REPLI-g. Storage formats: 50 µl REPLI-g reactions: 1) without further manipulation ("50 µl REPLI-g"); 2) aliquoted to 5 µl volumes ("5 µl REPLI-g"); 3) purified with QIAamp Mini Kit ("50 µl QIAamp purified REPLI-g"); and 4) diluted to a concentration of 50 ng/µl (50 µl diluted REPLI-g").
2
创新的去污染流程。
在REPLI-g sc Reaction Buffer中加入细菌DNA(2000个拷贝),然后使用紫外线照射,按照REPLI-g Single Cell Kit的操作流程进行操作。在后续的real-time PCR反应中,未检测到细菌DNA。
3
二代测序的结果差别较小。
在Illumina MiSeq仪器上对枯草芽孢杆菌的基因组进行全基因组测序。为进行分析,将2 μg基因组DNA、或使用REPLI-g Single Cell Kit从单细胞(三个不同的单细胞实验)和103个细胞扩增的DNA,剪切成300 bp大小的片段,每个取1 μg用于文库制备。[A]REPLI-g Single Cell扩增的DNA*覆盖的序列可与基因组DNA的序列相比。[B]比较未扩增和REPLI-g扩增的DNA发现,二者都的错误率都在类似的、较低的范围内。

*使用Burrows-Wheeler Alignment程序进行比对(范围:10倍覆盖):bio-bwa.sourceforge.net。
比较未扩增和REPLI-g Single Cell扩增的DNA发现,序列与基因组有高比率的匹配(数据未展示)。
4
完全的基因组覆盖。
使用RT2 qPCR Primer Assays (QIAGEN)对整个基因组的267个位点进行全面分析,对使用REPLI-g Single Cell Kit从3个不同单细胞实验扩增的DNA进行real-time PCR。CT值稳定且较小,无标志物丢失,表明可成功扩增基因组上的各个区域,非常适合单细胞基因组学。
5
对单细胞进行无偏差的DNA扩增。
使用来自供应商G、N和S的试剂盒和REPLI-g Single Cell Kit扩增5个人类细胞。[A]Real-time PCR分析3个标志物,以鉴定基因组位点的丢失和可变性。与其他供应商的试剂盒不同,REPLI-g Single Cell WGA对每个标志物有相同的CT值,表明可无偏向性地扩增5个细胞的DNA。与REPLI-g Single Cell Kit不同,使用供应商G和N表现出较高的丢失率。使用这两种试剂盒,5个细胞中的2个都无法扩增出基因组标志物X54,使用供应商G的试剂盒,5个细胞中的2个无法扩增出标志物99,说明基因组覆盖不完全,扩增有偏向性,这些试剂盒不适合可靠的单细胞研究。
6
REPLI-g Single Cell Kit实验流程。
两个易操作流程确保从1–1000个细胞或基因组DNA上进行WGA。使用REPLI-g Single Cell Kit进行全基因组扩增包括3个简单步骤,不管起始材料是1–1000个细胞(Protocol 1)还是10 ng基因组DNA (Protocol2)。首先,样品需经过轻度的碱变性,避免片段化和模板DNA的损害。然后,样本被中和,最后再和REPLI-g Single Cell预混液在30°C下孵育。不管起始材料如何,REPLI-g Single Cell Kit都能获得高产量、高品质的全基因组扩增DNA。
7
在二代测序中使用REPLI-g技术扩增获得的DNA,缩短手动操作时间,获得更多序列信息。
用于下一代测序的PCR法全基因组扩增(WGA)和文库制备需要在文库制备前进行纯化,与REPLI-g法WGA文库制备相比需要3倍的手动操作时间。而且,与REPLI-g扩增DNA不同,PCR法在WGA扩增产物中还包括PCR引物结合位点(红色指示)。由于二代测序读取长度在50–200 bp间,使用基于PCR的WGA法可能极大降低基因组覆盖率。
8

Unbiased amplification with Phi29 polymerase.

[A] Upon encountering secondary DNA structures, Taq polymerase may pause synthesis, slip, or dissociate from the template. This can result in inaccurate DNA amplification, incomplete loci coverage, and short fragment sizes. [B] REPLI-g Kits utilize Phi29 polymerase, which displaces secondary structures enabling accurate and highly uniform amplification of the entire genome.
9
Multiple Displacement Amplification (MDA) technology.

Primers (arrows) anneal to the template DNA and are extended at 30°C by Phi 29 polymerase, which moves along the DNA template strand, displacing the complementary strand, while becoming a template itself for replication. In contrast to PCR amplification, MDA does not require different temperatures and ends in very long fragments with low mutation rates.

Performance

覆盖基因组所有位点,十分适用于二代测序和其他下游应用

REPLI-g Single Cell Kit扩增的DNA平均长度大于10 kb,并且覆盖所有基因组位点。该产品已经过验证,适用于二代测序、基于芯片技术的比较基因组杂交(aCGH)和real-time PCR应用等多种下游分析。使用该产品无需单独进行PCR扩增,减少了手动操作,获得的产物长度PCR方法更长(参见"Next-generation sequencing using REPLI-g amplified DNA requires less hands-on time and generates more sequence information than PCR-based methods")。用扩增产物进行二代测序,获得高品质结果。这表明该试剂盒的位点覆盖率大,错配率低,其扩增的DNA(甚至从单一细菌细胞中扩增的DNA)能够与纯化获得的基因组DNA相媲美(参见"Comparable NGS results")。另有研究对人类常染色体和X染色体上的多个标记物进行了分析,三个独立的实验均显示:基因组的所有位点被成功扩增,没有遗漏任何一个位点(参见"Complete genome coverage")。

表1. 样本类型和研究领域
样本类型(细胞/DNA) 研究领域
人类/动物 生物标记物研究(SNP、突变、CNV)
干细胞研究
循环胚胎细胞分析
嵌合体研究
遗传易感性研究
转基因动物基因分型
癌症 体细胞遗传变异分析
肿瘤恶化
肿瘤干细胞/进化
循环肿瘤细胞分析
细菌 宏观基因组学研究
病原体分析
微生物基因分型
Plants* 植物气孔研究
花粉分析
* 没有细胞壁的细胞或纯化的基因组DNA。

REPLI-g Single Cell Kit的表现优于其他供应商的试剂盒

其他供应商的试剂盒基于PCR技术进行全基因组扩增,获得的产物片段较短,带有PCR引物序列,可能影响下游应用。基于PCR的全基因组扩增容易出现错误,会导致碱基对突变、STR的减少或增多,使用低保真Taq DNA聚合酶会导致位点缺失。相反,REPLI-g Single Cell Kit能够进行高度均一的全基因组扩增,位点偏差小。对四个试剂盒进行了检测,其中两个利用多重置换扩增技术(包括REPLI-g Single Cell Kit),另外两个利用PCR技术。采用单一细胞扩增实验方案对所有试剂盒进行序列位点检测。除REPLI-g Single Cell Kit外的其他供应商的试剂盒都出现了位点的遗漏(参见"Unbiased DNA amplification from a single cell")。

Principle

REPLI-g Single Cell Kit含有REPLI-g sc Polymerase,这是一种优化的新型高保真Phi 29聚合酶。该试剂盒采用多重置换扩增技术扩增复杂的基因组DNA,温和的碱孵育能够避免DNA片段化,促进对所有位点的无偏差扩增。该试剂盒十分适用于分离的肿瘤细胞或细菌细胞等单一细胞,能够扩增获得高产量DNA(参见表1)。此外,该试剂盒还配有专用于鲜血或干血、新鲜或冷冻组织的实验方案,可用于多种研究样本。常规DNA产量可达40 µg,对模板的起始量要求低,因此进行后续遗传分析时无需检测DNA浓度。REPLI-g Single Cell Kit的扩增产物平均长度超过10 kb,且覆盖所有位点,适合于多种应用,包括二代测序、基于芯片技术的比较基因组杂交、焦磷酸测序和real-time PCR分析(参见表2)。

表2. 下游应用和仪器
应用 仪器
全基因组测序 二代测序平台
外显子组测序
SNP基因分型芯片 芯片平台
Array CGH
qPCR/PCR技术 Real-time PCR/PCR仪
Sanger测序 毛细管测序仪
焦磷酸测序 PyroMark (QIAGEN)
多家供应商均有销售

扩增原理

REPLI-g Single Cell Kit采用等温基因组扩增技术,即多重置换扩增(MDA)。六聚体与变性DNA随机结合,然后在等温条件下,在优化的Phi 29聚合酶作用下,发生链置换合成反应。每个置换后的单链作为模板,与引物结合,可扩增获得高产量DNA(参见"Multiple Displacement Amplification (MDA) technology")。Phi 29聚合酶为噬菌体衍生酶,具有3'→5'引物外切酶活性(校正活性),其保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi 29聚合酶在优化的REPLI-g Single Cell缓冲液体系中,能够轻松的打开发卡结构等二级结构,因此可促进扩增时聚合酶正常工作。可扩增获得长达100 kb的DNA片段(参见"Unbiased amplification with Phi 29 polymerase")。

细胞裂解和DNA的碱变性 

基因组DNA在用于酶促扩增反应前必须经过变性,而这一变性过程通常使用高温或高pH值(强碱)孵育。REPLI-g Single Cell Kit采用温和的碱孵育,在细胞裂解、DNA变性的同时,确保DNA片段化程度小,不产生碱基突变。因此扩增获得的DNA完整度高,产物长度长,覆盖位点多(参见"Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation")。

高效去除可检测到的DNA污染

REPLI-g Single Cell Kit中的所有组分都经过了独特的去污染流程,避免扩增产物被污染。在标准化流程中,对缓冲液和试剂进行紫外线照射,确保其不会污染DNA(参见"Innovative decontamination procedure")。紫外线照射后,对试剂盒的所有组分进行严格的质量控制,确保其性能。

Procedure

简单的单管操作

REPLI-g Single Cell Kit可对单一细胞或有限的样本进行简便、可靠、准确的全基因组扩增。反应体系构建十分便利、可靠,仅需15分钟左右的手动操作(参见"REPLI-g Single Cell Kit procedure")。专用的缓冲液和试剂可对单一细胞、有限的组织材料、或纯化的DNA进行扩增,产量高、位点覆盖率大(参见表3)。REPLI-g技术扩增获得的DNA可在–20°C长期储存(参见"Consistent long-term stability")。请参见表4,了解REPLI-g产品线的更多信息。

表3. REPLI-g Single Cell Kit的成分
试剂盒成分 优势
REPLI-g sc Polymerase 最长可达70 kb的长片段
保真性是Taq聚合酶的1000倍
覆盖所有位点
均一扩增所有位点
REPLI-g sc Reaction Buffer 对所有位点进行无偏差的扩增
Buffer DLB (裂解和变性) 高效扩增
不损伤DNA
紫外线照射去除污染 减少可检测到的残留DNA污染
含有盐、引物和dNTP
表 4. 多种REPLI-g Kits的规格
REPLI-g Single Cell REPLI-g Mini REPLI-g UltraFast Mini REPLI-g Midi REPLI-g Screening REPLI-g FFPE REPLI-g Mitochondrial DNA
起始材料 单一细胞、gDNA 纯化的基因组DNA、血液、细胞 纯化的基因组DNA、血液、细胞 FFPE组织、FFPE组织中纯化的基因组DNA 纯化的基因组DNA
另外提供其他起始材料的实验方案
起始量 单一细胞、2–1000各细胞、组织、纯化的gDNA (1–10 ng) >10 ng gDNA、0.5 µl血液或细胞(>600个细胞/µl) >10 ng gDNA、0.5 µl血液或细胞(>600个细胞/µl) 组织切片(直径1 cm,厚度10–40 µm);>100 ng gDNA >1 ng纯化的gDNA
产量(µg/反应) 40 10 7–10 40 8 标准产量:≤10; 高产量:≤40 3–5
反应时间 8–16小时 10–16 小时 1.5小时 8–16小时 12–16小时 标准产量:4小时;高产量:10小时 8小时
手动操作时间 15分钟 15分钟 15分钟 15分钟 15分钟 40分钟 15分钟
规格 反应管 反应管 反应管 反应管 孔板
Applications
使用REPLI-g Single Cell Kit扩增获得的DNA可用于多种下游应用,包括:
  • 二代测序
  • 采用TaqMan引物/探针对进行的SNP基因分型
  • 基于qPCR和PCR的突变检测
  • STR/微卫星分析
  • Sanger测序
  • 焦磷酸测序
  • aCGH等芯片技术

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试剂盒操作手册 (1)
For whole genome amplification from single cells, limited samples, or purified genomic DNA
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补充实验方案 (12)

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This protocol is optimized for whole genome amplification from biopsies using the REPLI-g Single Cell Kit.
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This protocol is optimized for whole genome amplification from buccal cells using the REPLI-g Single Cell Kit.
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产品介绍与指南 (2)
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