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REPLI-g Single Cell DNA Library Kit

适用于illumina测序平台的单细胞DNA文库构建
  • 无需PCR的无偏倚单细胞文库构建
  • 从单细胞开始的完整而准确的测序覆盖度保证
  • 标准化操作步骤确保快速的结果获取
  • 高质量的文库可即用于任何Illumina NGS平台
单细胞基因组分析使得科研学者在一系列研究应用领域如发育生物学、肿瘤异质性研究以及疾病发生发展等方面获得全新的见解。由于单细胞中存在的基因组DNA量极其有限,基于二代测序(NGS)的单细胞基因组分析研究一直以来进展缓慢。传统基于PCR扩增的全基因组扩增普遍存在错误率较高、低覆盖均一度、大量等位位点信息缺失以及扩增产量偏低等问题。全新开发的REPLI-g Single Cell DNA Library Kit充分利用了QIAGEN独特的多重置换扩增(MDA)技术的优势,制备产生的测序文库在保留样本基因组多样性的同时还具有较高的保真性和较低的偏倚率。
Cat No./ID: 150354
REPLI-g Single Cell DNA Library Kit (48)
REPLI-g sc DNA Polymerase, buffers and library prep reagents for 48 whole genome amplification reactions and subsequent end-repair, A-addition and NGS adapter-ligation; for use with Illumina NGS instruments

REPLI-g Single Cell DNA Library Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0
High-quality libraries with a high percentage of mapped reads and a very low percentage of duplicates.
For analysis, 1 cell, 10 cells or gDNA were used as starting material. WGA was carried out for 3 h or 8 h. The complexity of libraries prepared using the REPLI-g Single Cell DNA Library Kit was very high, as indicated by the extremely low percentage of duplicates detected, enabling efficient use of sequencing capacity. Similar results were obtained independent of the amount of starting material and incubation time.
0
A time-saving, streamlined protocol delivers ready-to-use libraries, suitable for use on Illumina NGS platforms.
The REPLI-g Single Cell DNA Library Kit provides a complete workflow for highly uniform amplification across the entire genome, with minimal sequence bias, followed by fast, one-tube library construction.
1
Superior performance, greater accuracy and more even coverage.
For analysis, 1 pg E. coli DH10B DNA was amplified with either the REPLI-g Single Cell DNA Library Kit or by the MALBAC (Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles) method (Supplier Y) and sequenced on a MiSeq instrument (V2, 2x150 nt). The REPLI-g Single Cell DNA Library Kit generated >10x the yield, with significantly improved accuracy than the MALBAC method and ensured more even coverage than MALBAC.
2
The REPLI-g Single Cell DNA Library Kit outperforms PCR-based single cell library prep.
Data from libraries constructed from one HeLaS3 cell is shown. Compared to a PCR-based single cell library kit, the REPLI-g Single Cell DNA Library Kit provided a higher percentage of mapped reads and an extremely low percentage of duplicates.
3
Uniform coverage over a wide range of %GC content.
Compared to a product from Supplier R, libraries generated using the REPLI-g Single Cell DNA Library Kit provided more uniform coverage over a wide range of GC content (%).
Performance
一天内即可完成的标准化单管式文库构建
使用REPLI-g Single Cell DNA Library Kit时,反应体系构建的工作得到了极大的简化且实验手工操作时间也得到了极大的减少,使得整体的DNA扩增及文库构建过程在一天之内即可完成。该试剂盒所采用的单管式文库构建方案在步骤之间无需样本纯化步骤,最大程度地减少了对于起始样本的损失以及交叉污染的可能。MDA及文库构建过程的协同优化使得实验流程更加的流畅高效,减少了MDA的扩增时间并去除了文库扩增的步骤。优化的反应酶及溶液体系保证了超一流的高质量文库产量,一天之内即可成功构建用于NGS的文库。
 
不含PCR的实验流程保证了最小的偏倚
正常情况下,PCR反应对于高GC或AT区域的DNA片段扩增效率很低或无法进行扩增,从而得到错误的测序或NGS结果。REPLI-g Single Cell DNA Library Kit通过使用具有高保真性的MDA技术,使得扩增结果只含有可忽略的序列偏倚及最小的基因型信息丢失。REPLI-g Single Cell DNA Library Kit含有经优化的Phi29聚合酶,在保密配方的体系缓冲液配合下,保证了基因组范围内高GC含量区域的均一化扩增,从而保证了后续测序反应的均衡覆盖。此外,Phi29聚合酶因具有1000倍普通PCR聚合酶的高保真性而使得REPLI-g扩增产生的假阳、阴性结果降低到最低。试剂盒中专门配备的缓冲液及试剂可进行特殊而有效的去污染步骤,避免对于污染的DNA进行扩增,保证了结果的高度可靠。 
高质量测序文库
REPLI-g Single Cell DNA Library Kit将REPLI-g Single Cell的独特优势与GeneRead技术的连接效率进行有机的结合,诞生了适用于NGS的高质量文库构建产品,实验过程无需任何文库富集步骤,从而避免了额外的扩增偏倚。由于WGA步骤得到的高产量产物以及文构建试剂所能达到的高效连接效率,文库构建的过程已不再需要基于PCR的文库扩增过程,避免了可能引入的覆盖度及文库多样性问题。该试剂盒适用于单细胞或微量DNA样本的复杂文库构建,结果具有高比例的读长定位率、均一的基因组覆盖度、高度的序列复杂性以及极低的错误发生率等特点,构建效果好于其他基于PCR技术的单细胞文库构建方案。
Principle

REPLI-g Single Cell DNA Library Kit中含有的REPLI-g sc DNA Polymerase,是一种优化后的创新性高保真Phi29聚合酶,可通过多重置换扩增(MDA)技术来对复杂的基因组DNA进行扩增,操作过程中温和的碱裂解步骤可保证极低的DNA片段化概率或者无碱基位点的产生。该试剂盒是专门为单细胞样本提供高产量扩增DNA而设计的。

扩增原理

REPLI-g Single Cell DNA Library Kit使用的是一种名为多重置换扩增(MDA)的等温基因组扩增技术,扩增起始于随机六聚体引物与变性DNA的结合。后续的扩增反应通过优化状态下的Phi29聚合酶,一种具有极强链置换功能的聚合酶,在恒温条件下的链置换合成而进行。而被置换成单链的DNA链又可被作为模板持续进行上述的扩增反应,从而产生高产量的扩增后DNA。Phi29这种来源于噬菌体的聚合酶因具有3'→5'外切酶活性(校正活性),而可提供高于Taq DNA聚合酶1000倍的高保真能力。此外,在独特经优化的REPLI-g Single Cell缓冲液体系的支持下,Phi29聚合酶可轻松解决二级结构如发卡茎环带来的扩增问题,避免了DNA聚合酶在扩增过程中发生滑脱、中止以及解离等情况,保证了扩增产物DNA片段在没有序列偏倚的情况下最长可达到100kb。

细胞裂解及DNA的碱变性

基因组DNA必须经过变性后才能用于酶促的扩增反应过程,但通常的变性方法如高温孵育(热孵育)、提高pH(化学性碱孵育)等过于强烈。REPLI-g Single Cell DNA Library Kit使用的是一种温和的碱孵育方法,有助于有效的细胞裂解及均一的gDNA变性,并保证极低的DNA片段化概率和无碱基位点的产生。扩增后的DNA具有极高的完整性及最大的扩增片段长度,从而保证了基因组中位点及序列的均一性呈现。

有效去除可检测到的DNA污染

该试剂盒中用于WGA的所有成分均经过特殊的、有效的去污染步骤,保证所有可被扩增的污染DNA的有效去除。所有涉及的缓冲液及试剂在生产过程中均经过创新性、标准化的特殊处理步骤,保证所有可被检测到的污染DNA的完全去除。除了去污染步骤之外,该试剂盒还需经过一系列严格的质控来保证其功能的完全实现。

Procedure
简单的单管式操作流程 – 一天内完成NGS前文库构建

REPLI-g Single Cell DNA Library Kit可为Illumina NGS平台在5-5.5小时内提供一种简单而快速制备DNA文库的方法,起始样本只需单个细胞或低至pg级的DNA。该试剂盒可提供完整的全基因组范围内高度均一化扩增流程,保证几乎没有序列偏倚产生,下游紧接的是快速的、单管式文库构建步骤。专门设计的缓冲液和试剂可保证从单细胞、少量样本或纯化的DNA中获得高产量的扩增后DNA,并确保序列的完全再现及扩增的无偏倚。

WGA首先进行的细胞样本裂解及DNA的变性,在加入中和缓冲液中止变性后,一种含有缓冲液和DNA聚合酶的预混液将会被加入到反应体系中,并可利用热循环仪设置30°C恒温扩增3小时。REPLI-g SC扩增后的DNA可在–20°C长期稳定保存,或直接用于后续文库的构建。在文库构建的过程中,有较长DNA片段组成的样本将首先被打断成随机的文库片段。片段长度的中间值一般由下游应用及测序读长而确定,随后进行末端修复、加A尾等过程,并且平台特异性接头将会被连接到DNA文库的双端,使得文库适用于后续的测序过程。WGA过程一般可产生较高产量的DNA,因此将会有较多量的起始DNA可用于文库构建的过程而后续基于PCR的文库富集步骤可以被省略。然而,如果仍需文库富集步骤,也可选择一种经优化的高保真性扩增步骤用于提供低错误率及最小偏倚的高准确度文库DNA。
Applications
REPLI-g Single Cell DNA Library Kit可提供一种用于单细胞样本的高效、无需PCR的文库构建方法,特别适合于发育生物学研究、微生物研究、肿瘤细胞异质性分析以及循环肿瘤细胞的基因组多样性研究。
  • 无需PCR的无偏倚单细胞文库构建 
  • 从单细胞开始的完整而准确的转录组测序覆盖度保证
  • 标准化操作步骤确保快速的结果获取
  • 对于低丰度转录本实现最小的扩增偏倚及灵敏检测
  • 高质量的文库可即用于任何Illumina NGS平台

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