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REPLI-g Midi Kit

对微量或者珍贵样本进行高度均一的全基因组扩增

  • 扩增获得40 µg DNA,产量稳定
  • 同时扩增多个基因组位点
  • 使用多重置换扩增反应获得可靠结果
  • 扩增获得的DNA适用于多种下游应用
  • 长期储存不会导致DNA降解

REPLI-g Midi Kit提供优化的试剂,利用多重置换扩增(MDA)技术,对微量或珍贵样本进行高度均一的全基因组扩增(WGA)。50 μl反应体积的常规DNA产量为40 μg,产物的平均长度长于10 kb(在2 kb至100 kb之间)。独特的REPLI-g技术能够从多种类型的微量或珍贵样本中高度均一的进行全基因组扩增,起始样本包括纯化后基因组DNA、新鲜血液或或干血、口腔拭子、新鲜或冷冻组织或细胞。该方法可便利、准确的扩增基因组DNA,得到的DNA可即用于无需标记的多种下游应用,无需进行纯化或定量检测。与基于PCR的全基因组扩增技术相比,这种方法的无错配率提高了1000倍,避免出现假阴性或假阳性结果。

Cat No./ID: 150043
REPLI g Midi Kit (25)
DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 25 x 50 µl whole genome amplification reactions (typical yield 40 µg per reaction)
Cat No./ID: 150045
REPLI g Midi Kit (100)
DNA Polymerase, Buffers, and Reagents for 100 x 50 µl whole genome amplification reactions (typical yield 40 µg per reaction)
Cat No./ID: 150090
REPLI g Human Control Kit 25
Human control DNA for 25 x 50 µl whole genome amplification reactions

REPLI-g Midi Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0
任何类型样本都能获得高产量DNA。
使用REPLI-g Midi and Mini Kits扩增各种起始材料,包括基因组DNA、肝素和EDTA保存的全血。常规产量为40 µg (Midi Kit) 和8–10 µg (Mini Kit)。
1
高效的热变性和碱变性,位点序列信息不丢失。
通过加热(95°C)或标准的REPLI-g Kit碱裂解法使基因组DNA样本(10 ng)变性。使用REPLI-g DNA Polymerase扩增后,比较样本2个位点的CT值。REPLI-g Kit碱裂解法扩增获得的位点CT值较低,表明这些位点的序列信息并未丢失。
2
长期保存具有稳定性。
对REPLI-g扩增的DNA样本进行real-time PCR,这些样本以4种不同形式在–20°C下保存了图示时间。检测每个样本的两个位点,[A]位点A和[B]位点B。gDNA:未用REPLI-g扩增的基因组DNA。保存形式:50 µl REPLI-g反应液:1) 未进一步处理("50 µl REPLI-g");2) 分装为5 µl体积("5 µl REPLI-g");3) 使用QIAamp Mini Kit纯化("50 µl QIAamp purified REPLI-g");4) 稀释至浓度为50 ng/µl ("50 µl diluted REPLI-g")。
3
基因组DNA和REPLI-g扩增获得的DNA,在二代测序中表现相当。
对枯草芽孢杆菌的基因组进行全基因组测序。为进行分析,将2 μg基因组DNA、或REPLI-g Midi Kit从105个细胞扩增的DNA,剪切成300 bp大小的片段。每个取1 μg用于文库制备。在Illumina MiSeq仪器上进行测序。[A]基因组DNA和REPLI-g扩增的DNA得到的序列覆盖率相当。[B]基因组序列位点的比对表明,REPLI-g扩增的DNA的位点与基因组DNA相似度高,说明WGA(全基因组扩增)后DNA丢失水平较低。未扩增与REPLI-g扩增的DNA相比,错误率(错配、高级错误、缺失或嵌合体)在相同的比率范围。(使用SMALT [Welcome Trust Sanger Institute]进行比对。)
4
REPLI-g Mini and Midi实验流程。
使用REPLI-g Mini Kit扩增基因组DNA包括3个基本步骤。首先,样品(10 ng纯化的基因组DNA,0.5 µl全血或组织培养细胞)需经过温和的碱变性,避免片段化和对模板DNA的损害。然后,样本被中和,最后再和REPLI-g预混液在30°C下孵育。
5
准确的基因分型。
利用REPLI-g技术扩增20个DNA样本,后续不进行DNA纯化,直接对3个STR位点(CSF1PO、TPOX、和THOI)进行基因分型分析。将结果与为扩增的基因组DNA的基因型进行比对。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA,并用银染色。只有一条带的泳道代表纯合子,两条带的泳道表示该STR位点为杂合子。
6

Schematic representation of REPLI-g amplification.

Phi 29 polymerase moves along the DNA template strand displacing the complementary strand. The displaced strand becomes a template for replication allowing high yields of high-molecular–weight DNA to be generated.

7
使用Phi29聚合酶进行无偏差的扩增。
[A]当遇到DNA二级结构时,Taq聚合酶可能停止合成、跳过或从模板上解离。这可能导致不准确的DNA扩增、不完整的位点覆盖和DNA片段短。[B]REPLI-g Kits使用Phi29聚合酶,可替换二级结构,对整个基因组进行准确和高度统一的扩增。
8
REPLI-g技术的位点覆盖率出色。
使用定量real-time PCR对DNA样本的8个位点进行检测,DNA样本分别使用[A]REPLI-g技术[B]DOP-PCR和[C]PEP技术扩增而来。位点是否存在是与1 µg未扩增的对照DNA比较而确定的。
9
稳定、准确的全基因组扩增。
对使用REPLI-g技术扩增而来的44个不同样本的47个人类位点(每个常染色体对2个位点,X染色体两个位点,Y染色体1个位点)进行real-time PCR。每个样本被扩增约10,000倍,而覆盖位点的最大偏差只有6倍。
10
多种样本量可获得稳定的DNA产量。
不同量的人类基因组DNA在标准REPLI-g Midi Kit反应中扩增,在图示时间点取样。无论起始材料量的大小,从50 µl反应中扩增的DNA产量约为40 µg。
11
可靠的SNP基因分型。
使用REPLI-g技术扩增的DNA不经纯化,使用TaqMan分析对2个随机选取的位点(WIAF-1004和WIAF-622)进行SNP基因分型。等位基因的紧密集群能可靠确定纯合子和杂合子的基因型。
Performance

从多种样本中得到高产量DNA,可用于多种应用

REPLI-g Mini Kit可用于多种样本,包括基因组DNA、新鲜或干血、新鲜或冰冻组织、细胞。50 μl反应体系的常规DNA产量可以达10 μg(参见"Consistent DNA yields using any sample type")。不同的模板质量均可扩增得到同样的DNA产量(参见"Uniform DNA yield from various amounts of template")。从不同的模板浓度获得一致的DNA产量十分要,对于高通量应用而言尤其如此,在下游的基因分析中不需要纯化或定量。

产物平均长度大于10 kb,在2 kb到100 kb之间,因此能够用于复杂的限制性酶切和长片段PCR等下游应用。REPLI-g扩增的DNA十分适用于基因分型,如使用TagMan引物/探针对的SNP基因分型(参见"Reliable SNP genotyping "),测序和STR/微卫星分析(参见"Accurate genotyping")。

成功应用于二代测序

许多文献已展示了REPLI-g技术扩增的DNA在二代测序中的成功应用,包括肿瘤细胞的外显子组测序、全基因组测序、宏基因组学的研究、以及单细胞分析。对于将全基因组扩增DNA用于二代测序一直有一些争论,因此我们检测了可能影响全基因组扩增DNA在下游应用中表现的影响因素。我们发现:起始材料的质量对二代测序实验有很大影响。如果使用的是低质量DNA(如降解的DNA),或长时间保存的组织材料,用扩增获得的DNA进行二代测序则无法获得可靠结果。但是,对完整细胞或未降解的纯化后DNA使用REPLI-g技术进行全基因组扩增,然后用于二代测序,结果可与纯化的基因组DNA的测序结果相媲美。分析测序结果的各基因组位点和错配率得出结论,全基因组扩增后垃圾DNA水平低,扩增获得的DNA和纯化获得的DNA的错配率基本相同(参见"Comparable NGS (next-generation sequencing) results obtained using purified gDNA or REPLI-g amplified DNA")。

高度可靠的全基因组扩增

REPLI-g技术提供高度均一的全基因组扩增。Phi29聚合酶可复制长达70 kb的DNA,而不会从DNA模板上脱离(参见"Schematic representation of REPLI-g amplification")。与基于PCR的全基因组扩增技术不同,Phi29聚合酶具有3'→5'外切酶校对活性,在复制过程中的高保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。试剂盒中提供的抗外切酶的引物可确保DNA的高产量,优化的全基因组扩增缓冲液体系适用于长片段DNA,对各位点进行均一的扩增。

REPLI-g技术的性能优于基于PCR的全基因组扩增技术

传统方法扩增基因组DNA需要进行耗时的EBV转化细胞系步骤,并用随机或变性的寡聚核苷酸引物进行全基因组扩增。基于PCR的方法(如:DOP-PCR和PEP)会产生非特异性的扩增产物,不能完全覆盖所有位点。有时,产生小于1 kb的DNA,在许多下游应用中都无法使用。由于使用低保真酶Taq DNA聚合酶,产物DNA突变率较高,扩增易出错,会导致碱基对突变。REPLI-g技术没有这些缺陷,并能够高度均一的扩增全基因组,位点偏差小、错配率小(参见"Highly representative amplification using REPLI-g technology" and "Consistent and accurate whole genome amplification")。

Principle

独特的REPLI-g技术使用创新的高保真酶Phi29聚合酶,利用多重置换扩增(MDA)技术扩增复杂的基因组DNA,并结合温和的碱变性,均一的扩增基因组位点。REPLI-g Mini Kit的常规产量为10 µg,如需更多产量,可使用REPLI-g Midi Kit;因为这两个试剂盒的实验方案相同,反应体积也相同。反应体系构建十分简便,仅需约15分钟的手动操作时间,因此REPLI-g技术使用简便、可靠,适用于对少量或珍贵的样本进行完全、均一的扩增。

扩增原理

REPLI-g利用等温基因组扩增,即多重置换扩增(MDA)技术:随机引物与变性DNA结合,在等温环境中,在Phi29聚合酶的作用下,进行置换合成反应。每个置换的单链作为模板,与引物结合,扩增生成高产量的DNA(参见"Schematic representation of REPLI-g amplification")。Phi 29聚合酶为噬菌体衍生酶,具有3'→5'外切酶活性,准确性为Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi29聚合酶与独特的REPLI-g缓冲液体系相配合,能够轻松的打开DNA的二级结构,如发卡结构,所以可确保在扩增过程中,聚合酶正常发挥作用。因此该技术生成的DNA片段长度可达100 kb,没有序列偏差(参见"Unbiased amplification with Phi29 polymerase")。

DNA的碱变性

在酶扩增前,必须使基因组DNA变性,这通常是通过高温孵育、或在强碱性条件下进行的。REPLI-g Midi Kit采用温和的碱性环境孵育,使DNA变性,而片段化程度低,突变少。由此扩增获得的DNA十分完整,扩增的片段长,覆盖所有基因组位点和序列。使用REPLI-g Midi Kit能够获得可靠的结果,确保在下游应用中不出现假阳性或假阴性结果。采用热变性的WGA技术会损伤模板DNA,导致扩增结果不准确(参见"Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation")。

Procedure

便利的单管操作

REPLI-g Midi Kit通过简便、高效的方法从纯化的少量基因组DNA样本或直接从全血、干血卡、白膜层、组织、培养的细胞中进行准确的全基因组扩增(参见"REPLI-g Mini and Midi procedure")。加入裂解缓冲液使样本DNA裂解并变性,之后进行短暂孵育(参见"REPLI-g Mini and Midi procedure")。中和后加入预混液(包括REPLI-g Mini DNA Polymerase),在30°C过夜进行等温扩增。REPLI-g扩增获得的DNA刻在–20°C长期储存(参见"Consistent long-term stability")。

选择适合您实验需求的REPLI-g Kit(参见下表)。

表1. 种类丰富的REPLI-g Kits

REPLI-g Mini REPLI-g UltraFast Mini REPLI-g Midi REPLI-g Screening REPLI-g FFPE REPLI-g Mitochondrial DNA
起始样本 纯化后gDNA、血液、细胞 纯化后gDNA、血液、细胞 FFPE组织、FFPE组织中纯化得到的gDNA 纯化后gDNA
起始样本量 >10 ng gDNA, 0.5 µl blood or cells (>600 cells/µl) >10 ng gDNA, 0.5 µl blood or cells (>600 cells/µl) Section (1 cm diameter, 10-40 µm thick); >100 ng gDNA >1 ng纯化后gDNA
产量(µg/反应) 10 7–10 40 8 标准产量:≤10,高产量≤40 3–5
反应时间(小时) 10–16 1.5 8–16 12–16 标准产量:4,高产量:10 8
手动操作时间(分钟) 15 15 15 15 40 15
规格 反应管 反应管 反应管 孔板 反应管 反应管
Applications

REPLI-g扩增得到的DNA可用于多种下游应用,包括:

  • 使用TagMan引物/探针对的SNP基因分型
  • 基于定量PCR或PCR的突变检测
  • 二代测序
  • STR/微卫星分析
  • Sanger测序
  • RFLP和Southern印迹分析
  • 芯片技术,如比较基因组杂交

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