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EndoFree Plasmid Kit

纯化得到至多10 mg的无内毒素高转染级纯质粒或柯斯质粒DNA

  • 纯化得到的DNA内毒素水平低于0.1 EU/µg
  • 纯化流程快,同时去除内毒素
  • 获得高产量、高拷贝质粒DNA
  • 使用LyseBlue,获得最佳的裂解和高产量的DNA

EndoFree Plasmid Kits基于阴离子交换技术,可快速制备不含内毒素的质粒DNA。QIAfilter Cartridges过滤快速澄清裂解液。制备的DNA纯度超过两次CsCl梯度离心法所得DNA的纯度,适合超转染级纯的应用。EndoFree Plasmid Buffer Set可用于制备10次mega规模或5次giga规模转染级纯质粒或科斯质粒DNA制备。

Cat No./ID: 12362
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)
10 QIAGEN-tip 500, Reagents, 10 QIAfilter Maxi Cartridges, Endotoxin-free Buffers
Cat No./ID: 12381
EndoFree Plasmid Mega Kit (5)
5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, 5 QIAfilter Mega-Giga Cartridges, Endotoxin-free Buffers
Cat No./ID: 12391
EndoFree Plasmid Giga Kit (5)
5 QIAGEN-tip 10000, Reagents, 5 QIAfilter Mega-Giga Cartridges, Endotoxin-free Buffers
Cat No./ID: 19048
EndoFree Plasmid Buffer Set
Buffers P1, P2, P3, QBT, QC, QN, ER, TE, Endotoxin-free H2O, RNase A; for 10 plasmid mega- or 5 gigapreps (endotoxin-free)

EndoFree Plasmid Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0
质粒纯化方法与转染效率。
使用两种方法独立制备pRSVcat,分别使用脂质体介导的方法转染到COS-7、HeLa和LMH细胞中,及使用磷酸钙转染至Huh7细胞中。平均转染效率以相对于QIAGEN Plasmid Kit(100%)制备的DNA的转染效率表示。
1
QIAGEN Plasmid Kit实验流程。
将中和的细菌裂解液直接在QIAfilter Cartridge中孵育,之后通过过滤快速使其澄清。在去除内毒素的步骤之后,将澄清的裂解液上样至阴离子交换滤芯,这时质粒DNA在合适的低盐和pH值条件下,选择性结合到树脂上。RNA、蛋白质、代谢物和其他低分子量杂质在中盐溶液中被洗去,之后用高盐溶液洗脱得到超纯的质粒DNA。之后通过异丙醇沉淀使DNA脱盐,通过离心收集DNA。
2
质粒纯度与转染效率。
图中显示了在无血清条件下,在悬浮液中生长的CHO SSF3 X9细胞中,质粒DNA的数量和质量对转染效率的影响。每个点代表三次独立实验的平均值;Rel. LU:相对光单位。(数据由瑞士巴塞尔诺华公司的M. Zang-Gandor,提供。)
3
细菌细胞壁。
大肠杆菌细胞壁示意图。
Performance

EndoFree Plasmid Kit将高效的内毒素去除步骤整合到质粒纯化流程中,不需要额外步骤,也不需用亲和柱去除脂多糖。通过QIAfilter Mega-Giga Cartridge过滤细菌裂解液,并使用重力流QIAGEN-tip阴离子交换柱纯化质粒DNA。产量可达10 mg(Giga)、2.5 mg(Mega)、500 μg(Maxi)DNA。纯化的DNA无内毒素(<0.1 EU/µg DNA)。

选用EndoFree Plasmid Mega Kit而非EndoFree Plasmid Giga Kit纯化低拷贝质粒和科斯质粒,将会得到更好的效果,因为后者需要较大的培养体积,而QIAfilter Mega-Giga Cartridge的容量有限。

EndoFree Plasmid Kits去除细菌在裂解过程中释放的内毒素,内毒素会影响原代细胞和敏感培养细胞的DNA转染。从EndoFree Plasmid Kits得到的无内毒素DNA高度适用于可重复且结果可靠的转染(参见"Plasmid purification method versus transfection efficiency"和"Plasmid purity versus transfection efficiency"及表"Endotoxin levels in plasmid preparations"和"EndoFree DNA yields high transfection efficiencies with primary cells")。QIAGEN超纯无内毒素DNA也适用于基因治疗研究和其他敏感应用。

 
质粒制备中的内毒素水平*
质粒制备方法 内毒素(EU/µg DNA) 平均转染效率
EndoFree Plasmid Kit 0.1 154%
QIAGEN Plasmid Kit 9.3 100%
2x CsCl 2.6 99%
Silica-gel slurry 1230.0 24%
* 宿主菌:大肠杆菌DH5α  质粒:pRSVcat。
1  ng LPS = 1.8 EU。 
 根据表中数据计算 。
无内毒素DNA转染原代细胞的高转染率*
DNA纯化方法 转染细胞比例
EndoFree Plasmid Kit 21.0% ± 0.93
QIAGEN Plasmid Kit 8.1% ± 0.57
Silica-gel slurry 5.2% ± 0.74
* 原代兔胃壁细胞转染pEGFP-N2(CLONTECH),pEGFP-N2由所示的方法制备。使用Effectene Transfection Reagent进行转染。该数据是细胞表达GFP的百分率,由转染48小时后绿色荧光细胞数量确定。转染效率是每种纯化方法制备的超过2个不同的DNA中6–9个复制样本的平均值。(数据由C. Chew and J. Parente提供,Department of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia, USA.)
Principle

纯化的质粒DNA内毒素污染水平取决于所用的纯化方法(参见"Endotoxin levels in plasmid preparations")。硅胶技术纯化的DNA具有非常高的内毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和两次CsCl超速离心可获得相对低水平内毒素的纯DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的内毒素去除步骤,获得<0.1 EU/µg的质粒DNA。

QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊设计的过滤装置,用于代替细菌细胞碱裂解后的离心步骤。QIAfilter Cartridges可完全去除SDS沉淀,清除细菌裂解液,相比离心可大量节约时间,减少1小时的质粒纯化时间。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用内部真空方式轻松高效的清除大量细菌裂解液(注意:该试剂盒不包含瓶子)。

QIAGEN-tips中独特的阴离子交换树脂(不提供EndoFree Plasmid Buffer Set)专为核酸纯化而开发。它卓越的分离性能使得DNA纯度与连续两次CsCl梯度离心获得的DNA纯度相当。由重力流驱动并持续运转的预装QIAGEN-tips,最大限度减少手动制备质粒所需的时间。整个QIAGEN质粒纯化系统不使用有毒物质,如苯酚,氯仿,溴化乙锭和CsCl,最大限度地减少对用户和环境的危害。

内毒素,又称脂多糖或LPS,是大肠杆菌等革兰氏阴性菌细胞膜的组成部分,如大肠杆菌(参见"Bacterial cell wall")。内毒素在质粒裂解纯化过程中释放出来,并显著降低内毒素敏感细胞株的转染效率。此外,内毒素与DNA竞争“自由”转染试剂,影响转染实验中质粒DNA的摄取。内毒素也诱导巨噬细胞和B细胞等免疫细胞发生非特异性免疫反应,从而导致转染结果的误读。这些反应包括诱导的蛋白质和脂类,如IL-1和前列腺素等的合成。总体而言,内毒素在转染实验中是不可控变量,影响结果的可重复性,使它们难以对比、解读。在基因治疗研究中,内毒素可造成内毒素休克综合症和激活补体级联,干扰研究。

Procedure

在碱性条件下,细菌细胞裂解,使用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。将Endotoxin Removal Buffer加入到过滤后的裂解液中。冰浴后,将纯净的裂解物上样到阴离子交换柱上,在适当的低盐和pH条件下,质粒DNA选择性结合。用中盐缓冲液清除RNA、蛋白质、代谢产物和其他低分子量杂质,超纯质粒DNA被高盐缓冲液洗脱(参见"QIAGEN Plasmid Kit procedures")。最后DNA由异丙醇脱盐、沉淀并且离心回收。

Applications

使用EndoFree Plasmid Kits纯化的DNA适合多种敏感应用,包括:

  • 转染,包括原代、敏感以及悬浮细胞
  • 基因治疗研究
  • 基因沉默
  • 显微注射
Features
Specifications
应用 Transfection, gene therapy
起始样本体积 2.5 liters culture volume
质粒类型 High-copy, low-copy, cosmid DNA
处理 Manual (vacuum)
每次处理样本量;通量 1 sample per run
技术 Anion-exchange technology
每次运行时间或处理样本数 310 min
产量 <10 mg

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补充实验方案 (2)
Endotoxin-free DNA is essential for gene therapy research and will improve transfection into sensitive eukaryotic cells.
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This protocol is for purification of up to 100 µg endotoxin-free plasmid DNA using QIAGEN-tip 100.
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参考文献
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