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AllStars Negative Control siRNA

RNAi实验的阴性对照

  • 经最全面验证的阴性对照
  • 与已知的哺乳动物基因无同源性
  • 最小的非特异性效果
  • 可用于miRNA模拟实验

AllStars Negative Control siRNA是目前经过最全面的测试和验证的阴性对照siRNA。该siRNA与已知的哺乳动物基因无同源性。已经运用Affymetrix GeneChip芯片和多种细胞实验验证了其有效性,确保该siRNA对基因表达和表型的非特异性效应最小。通过比较基因特异性siRNA和阴性对照,可以得出靶基因敲减对基因表达和表型的影响,而最小的非特异性效应确保这一结论真实可靠。如果阴性对照引起非特异性效应,则RNAi实验结果会被干扰且难以解释。克隆实验证实AllStars Negative Control siRNA进入RISC。AllStars Negative Control siRNA正处于专利申请中,该序列是专有的。

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Thoroughly tested and validated nonsilencing siRNA with no homology to any known mammalian gene,
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AllStars Negative Control siRNA适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0
对基因表达的非特异性影响小。
将多个阴性对照siRNAs(Control 1– Control 10)一式三份转染到MCF-7细胞中。孵育后,制备cRNA并将其杂交到Affymetrix human U133 GeneChip芯片。与非转染细胞相比,基因表达出现至少1.5倍变化(包括上调和下调)的基因为调控基因。通路分析软件将调控基因与该信号通路中的总基因数相比较,确定调控在每个信号通路中所占比例。图中的柱形表示该信号通路中有基因由siRNA调控。如果所有的信号通路基因都受siRNA调控,则其比例为100%。较低的柱形表示调控基因占通路所有基因的比例相对较低。如果没有柱形,则说明该信号通路中的基因都不被siRNA调控。(箭头所指处)AllStars Negative Control siRNA的调控基因最少。与之相反,其他对照siRNA导致重要细胞信号通路中的调控基因较多。
1
不影响细胞数。
分别用AllStars Negative Control siRNA和其他阴性对照siRNA(Control 1)转染相同数量的MCF-7细胞。也对未转染的细胞进行分析。72小时后,收集细胞,用PBS清洗,转移至TruCOUNT管中,然后使用流式细胞仪计数。
2
AllStars Negative Control siRNA整合到RISC中。
用报告基因和非互补性siRNA或AllStars Negative Control siRNA共转染CF-7和HeLa细胞。24小时后,用[A]荧光显微镜(观测HeLa细胞)和[B]、[C]流式细胞仪观察荧光报告基因的表达情况。在非互补性siRNA转染后,可观测到正常强度荧光,表明报告基因已表达。在AllStars Negative Control siRNA转染后,荧光强度大幅度降低,表明报告基因的表达被下调。
3
Western印迹分析表明AllStars Negative Control siRNA进入了RISC。
用报告基因和非互补性siRNA或AllStars Negative Control siRNA共转染HeLa细胞。48小时后,采用Western印迹检测His标签的表达。His标签在非互补性siRNA转染后开始表达。AllStars Negative Control siRNA转染后,检测不到His标签。
4
正常的DNA合成表型。
HCT-116细胞(6 x 104[A]未转染,或[B]用AllStars Negative Control siRNA转染,或[C]用另一阴性对照siRNA(Control 1)转染。72小时后,用BrdU处理细胞、固定、透性化处理。然后用anti-BrdU–FITC抗体给细胞染色。采用流式细胞分析技术检测BrdU阳性细胞(M2区域)的比例,进而获得DNA的合成率。BrdU阳性细胞的比例在未转染细胞和AllStars Negative Control siRNA转染的细胞中的比例相近(53.1%和52.5%)。与之相反,Control 1转染的细胞中BrdU阳性细胞比例仅为10%,表明其影响了DNA合成。
5
细胞毒性没有增加。
MCF-7细胞[A]未转染,或[B]用AllStars Negative Control siRNA转染,或[C]用另一阴性对照siRNA(Control 7)转染。72小时后,用碘化丙啶给培养瓶中的所有细胞染色,用流式细胞仪计数,获得活细胞(未被染色)和死细胞(被染色)的数量。AllStars Negative Control siRNA转染的细胞的死细胞数与未被沾染的细胞中死细胞数相近(10.8%和10.1%的死细胞)。对照siRNA导致细胞死亡率达28.7%。
6
正常的细胞周期分布。
MCF-7细胞[A]未转染,或[B]用AllStars Negative Control siRNA转染,或[C]用CDC2 siRNA转染。CDC2 siRNA为阳性对照,因为CDC2的敲除会影响细胞周期,导致处于G2期的细胞积累。72小时后,使用胰蛋白酶使细胞与培养皿脱离,用70%的乙醇固定,然后用RNase处理,用碘化丙啶染色。对每个样本的40,000个细胞进行流式细胞仪计数。被AllStars Negative Control siRNA转染的细胞的细胞周期分布与CDC2 siRNA转染的细胞的细胞周期分布相似。后者的细胞如预期一样,多数处于G2期。
7
报告基因。
报告基因含有人工构建的、与AllStars Negative Control siRN互补的靶序列,并融合有带有His标签的荧光报告基因。
8
细胞核大小未受影响。
分别用AllStars Negative Control siRNA、阴性对照siRNA(Control 1)、和CDC2 siRNA转染HCT 116细胞。CDC2 siRNA为阳性对照,因为CDC2的敲除会影响细胞周期,导致细胞核增大。也对未转染的细胞进行了分析。72小时后,用Hoechst 33342给活细胞的细胞核染色,使用cell^R Imaging System(Olympus)测量单个细胞核的表面积。图中按照表面积大小,依次显示了每个实验的100个细胞核的大小。被AllStars Negative Control siRNA转染的细胞的细胞核大小与未转染的细胞的细胞核大小相近。被CDC2 siRNA转染的细胞如预期一样,细胞核增大。阴性对照siRNA,Control 1,也导致细胞核增大。
Performance

表中实验用来确证AllStars Negative Control siRNA的性能特征。

进行的实验
实验类型 实验名称 目的 使用AllStars Negative Control siRNA的结果
全基因分析 Affymetrix GeneChip芯片 非特异性调控基因表达 最少数目的基因被调控
细胞水平分析 活细胞核染色 核大小 正常
细胞水平分析 细胞数目 增殖速率 无变化
细胞水平分析 核酸整合 DNA合成率 无变化
细胞水平分析 活细胞染色排除 细胞毒性作用 无变化
细胞水平分析 DNA染色 细胞周期分布 正常
RISC整合分析(HeLa和MCF-7细胞) 报告质粒转染 确定siRNA是否整合入RISC(一个有效的阴性对照应整合入RISC) 整合入RISC
Affymetrix GeneChip芯片

转染多种阴性对照siRNA后,运用全基因组分析检测它们对基因表达的非特异性效应。使用HiPerFect Transfection Reagent将不同来源的多种阴性对照siRNA转染至MCF-7、K562和原代HUVEC细胞。这些阴性对照siRNA包括非沉默siRNAs(与哺乳动物基因无同源性)、干扰siRNAs(碱基组成与基因特异性siRNA相同而碱基序列不同的siRNAs)和靶向人工合成报告基因的siRNAs。随后,用Affymetrix GeneChip芯片测试人全基因谱的表达。使用AllStars Negative Control siRNA,非特异性调控基因最少,适合做阴性对照。而其它的阴性对照siRNAs则导致许多源于细胞通路的基因的非特异性调控(参见"Low nonspecific effects on expression")。

活细胞染色

活细胞核染色用于测量细胞核的大小。细胞核大小的变化可作为细胞周期紊乱或生长抑制的信号。我们测试了一系列不同类型的阴性对照siRNAs,AllStars Negative Control siRNA结果最好。与未转染的细胞相比,转染AllStars Negative Control siRNA不会改变细胞核的大小。相反,转染其他的阴性对照siRNAs会使细胞核增大(参见"Nuclear size phenotype unaffected")。

细胞数目

转染一系列阴性对照siRNAs后,进行细胞计数以确定细胞增殖是否正常。与未转染细胞相比,转染AllStars Negative Control siRNA后细胞数目几乎无差异。相反,转染其他的siRNAs后细胞数目显著下降,如Control 1,表明这些siRNAs会导致生长缺陷表型(参见"Cell number unaffected")。

核酸整合

通过检测未转染和转染了一系列不同阴性对照siRNAs的HCT-116细胞的核酸整合,以确定DNA合成率。通过检测溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)的摄取来测量核酸整合,BrdU是一种在DNA复制过程中代替胸腺嘧啶并可整合进新合成的DNA的胸腺嘧啶碱基类似物。DNA合成率的改变预示着细胞生长和细胞周期的变化。使用AllStars Negative Control siRNA转染的细胞,BrdU整合率与未转染细胞非常相似。然而,使用其他阴性对照siRNAs转染细胞,DNA合成率则较低,这表明该siRNA影响了细胞生长和细胞周期(参见"Normal DNA synthesis phenotype")。

活细胞染色排除

使用活细胞染色排除实验测一系列阴性对照siRNAs潜在的细胞毒性。结果显示,使用AllStars Negative Control siRNA转染的细胞与未转染细胞具有相同的活细胞数目。相反,其他的阴性对照siRNAs则导致细胞毒性增加(参见"No increase in cytotoxic effects")。

DNA染色用于细胞周期分析

细胞固定后用DNA染色法检测细胞周期的分布(处于G1/G0期、S期和G2期的细胞数量)。细胞转染AllStars Negative Control siRNA后,处于各细胞周期的细胞数的比例与未转染的细胞相似(参见"Normal cell-cycle distribution")。这一结果表明AllStars Negative Control siRNA没有对细胞周期产生不利影响。

报告质粒转染,确定是否整合入RISC

为了阴性对照RNAi实验的准确性,阴性对照siRNA应被整合到RISC(RNA诱导的沉默复合物)里。这意味着,阴性对照siRNA与基因特异性siRNA经过了相同的生物学过程,这使得我们能够比较使用基因特异性siRNA和阴性对照siRNA得出的两组数据,确信这是基因敲减的结果。

实验如下:

报告质粒包括一个人工合成的与AllStars Negative Control siRNA序列互补的siRNA靶向序列,该靶向序列与含有His标签的荧光报告基因相融合(参见"Reporter construct for RISC-incorporation experiment")。
该报告质粒与AllStars Negative Control siRNA和非互补siRNA共转染。同时分析未转染的细胞。
用荧光显微镜和流式细胞术检测荧光报告基因的表达。运用Western印迹通过His标签检测该融合蛋白的表达。

报告质粒和非互补siRNA共转染会导致荧光蛋白和His标签的强烈表达。当报告质粒和AllStars Negative Control siRNA共转染时,由它的互补序列将AllStars Negative Control siRNA的表达敲减,这使得整个编码荧光报告基因、His标签和siRNA目标序列的转录mRNA被降解。而mRNA的降解使得融合蛋白被敲减(参见"AllStars Negative Control siRNA is incorporated into RISC"和"Western analysis shows AllStars Negative Control siRNA enters RISC")。要实现对基因敲减的观测,必须将AllStars Negative Control siRNA整合到RISC。

Principle

转染阴性对照siRNA是每个RNA干扰试验必不可少的。阴性对照结果应该与从未转染细胞得到的结果相比较。转染阴性对照siRNA和未转染细胞的基因表达和表现型应该完全相似。如果在转染阴性对照siRNA的细胞里发现了基因表达和表现型的改变,这种改变是由转染过程或siRNA毒性和序列的非互补性引起的非特异性改变。为了确保RNAi/miRNA结果的可靠性,非特异性效应应该最小。

阴性对照结果也能与正在研究的基因特异性的RNAi/miRNA结果进行比较。这种比较使得研究者能准确描述靶基因敲减对基因表达和表现型的影响,因为阴性对照siRNA只是RNAi/miRNA的序列不同,而经历的生物学过程是完全相同的。

Procedure

AllStars Negative Control siRNA的结果可用于以下应用:

通过与未转染细胞的结果比较,可确定实验是否导致了非特异性效应 
通过与基因特异性siRNA的结果比较,可精确描述靶基因敲减的影响
在mRNA模拟实验中,通过与基因特异性miRNA模拟的结果比较,可精确描述靶基因下调的影响
Applications
  • 常规的RNAi实验
  • 起始RNAi实验
  • 高通量RNAi筛选
  • 与miRNA模拟转染有关的实验
Features
Specifications
设计 Predesigned/validated by Affymetrix GeneChip Array and cell-based assays
规格 Tube
修饰 Yes
规模或产量 5 nmol, 20 nmol
物种 Human, mouse, rat
提供的目标分子序列 No