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QuantiTect Whole Transcriptome Kit

对珍贵的RNA样本进行无限次real-time PCR分析

  • 高cDNA产量用于无限次分析和长期保存
  • 均一扩增所有cDNA和所有转录本区段
  • 经优化的试剂,快速简单的操作流程

QuantiTect Whole Transcriptome Kit对有限的RNA样品进行预扩增和逆转录,获得高产量cDNA,用于无限次real-time PCR基因表达分析。该试剂盒包含全转录扩增所需的全部酶和缓冲液。对Phi29聚合酶创新的修饰确保从低至1 ng RNA中制备多至40 μg cDNA。该聚合酶独特的加工过程可制备高度统一的cDNA,确保通过real-time PCR进行可靠的基因表达分析。

Cat No./ID: 207043
QuantiTect Whole Transcriptome Kit (25)
For 25 x 50 µl reactions: 25 µl T-Script Enzyme, 400 µl T-Script Buffer, 25 µl Ligation Enzyme 1, 25 µl Ligation Enzyme 2, 200 µl Ligation Reagent, 600 µl Ligation Buffer, 25 µl REPLI-g Midi DNA Polymerase, 730 µl REPLI-g Midi Reaction Buffer
Cat No./ID: 207045
QuantiTect Whole Transcriptome Kit (100)
For 100 x 50 µl reactions: 100 µl T-Script Enzyme, 400 µl T-Script Buffer, 100 µl Ligation Enzyme 1, 100 µl Ligation Enzyme 2, 200 µl Ligation Reagent, 600 µl Ligation Buffer, 100 µl REPLI-g Midi DNA Polymerase, 2 x 1.45 ml REPLI-g Midi Reaction Buffer

QuantiTect Whole Transcriptome Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0
cDNA产量具有可重复性。
使用QuantiTect Whole Transcriptome Kit扩增不同血液样本的总RNA (10 ng) 2或8个小时。使用PicoGreen试剂测定cDNA产量。
1
对5'和3'端的均衡扩增。
使用QuantiTect Whole Transcriptome Kit扩增总RNA (1 ng)。然后使用10 ng cDNA、β-actin特异性引物和QuantiTect SYBR® Green PCR Kit进行real-time PCR。β-actin转录本的5'和3'区域对应的扩增片段具有相似的CT值,表明QuantiTect Whole Transcriptome Kit可针对所有转录本区域进行同等扩增。
2
实验流程。
采用3个连续反应:逆转录、连接和全转录组扩增,从纯化的RNA中扩增cDNA。
3
可靠的real-time PCR分析。
使用QuantiTect Whole Transcriptome Kit扩增重复的RNA样本(各10 ng)。然后在Mx3005P系统上使用10 ng cDNA和QuantiFast Probe PCR Kit对标示靶点进行real-time PCR。重叠的曲线表示高度可重复的全转录组扩增。ACTB:β-actin;HPRT1:次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1。
4
全转录组扩增。
先利用模板RNA合成cDNA,然后进行连接(未显示)。REPLI-g DNA聚合酶沿cDNA模板链移动,替代互补链。被替代的链成为复制模板,生成高产量的cDNA。
5
保存转录本的特征。
使用QuantiTect Whole Transcriptome Kit扩增总RNA(1 ng)2小时(WTA 2 h)或8小时(WTA 8 h),然后使用10 ng cDNA对5个靶点进行real-time PCR。使用Sensiscript RT Kit逆转录RNA但不扩增(Non-WTA)作为对照,1/5的RT反应物用于real-time PCR。使用QuantiTect Probe PCR Kit进行real-time PCR。[A]WTA 2 hWTA 8 hNon-WTA样本中,5个转录本的相对基因表达水平相当(采用HPRT1标准化),如图中重叠的点所示。[B] WTA 8 h样本的ΔCT值(各靶点的CT值减去内对照 β-actin的CT值)(Y轴)与Non-WTA样本的ΔCT值(X轴)的曲线具有高线性度。[A] [B] 中的数据证明QuantiTect Whole Transcriptome Kit可保护转录本的特征。TP53:肿瘤蛋白p53;NFKB1:B细胞κ轻肽基因增强子核因子1;HPRT1:次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1;TBP:TATA盒结合蛋白;TNFRSF6B:肿瘤坏死因子受体超家族成员6b,诱骗受体。
Performance

QuantiTect Whole Transcriptome Kit确保所有转录子高度一致的扩增,这对于基因表达分析是必需的。所有mRNA转录子以相同的形式同时在5'和3'末端扩增(参见"Equal amplification of 5' and 3' regions")。图"Preservation of transcript profile", 显示高度稳定的转录子,该图将分别应用QuantiTect Whole Transcriptome Kit全基因组扩增的cDNA和用逆转录酶制备的未扩增cDNA进行了对比。

可获得多至40 μg的可重复、高产量的cDNA(参见"Reproducible cDNA yields")。能够进行无限次real-time PCR分析,并具有高度重复性的CT值(参见"Reliable real-time PCR analysis")。此外,由于cDNA比RNA更稳定,可以存档用于以后的研究工作。

高产量的cDNA可用于real-time PCR分析
起始材料 扩增时间 扩增产物的常规产量 可进行的real-time PCR次数*
10 ng RNA 2小时 至多10 µg cDNA 1000
10 ng RNA 8小时 至多40 µg cDNA 4000
* 从一次QuantiTect whole transcriptome amplification (WTA)扩增反应得到的cDNA可进行的real-time PCR次数。不使用WTA,10 ng RNA只能进行一次可靠的real-time RT-PCR分析。
Principle

获得的生物样本量太少可能限制基因表达谱分析。使用QuantiTect Whole Transcriptome Kit可对少量珍贵的样品进行无限次real-time PCR分析。QuantiTect Whole Transcriptome Kit经优化,用于1 ng RNA或相当于约50个细胞RNA的全转录扩增,甚至可以用更少量的RNA,这些取决于RNA的品质和转录子的丰度。

QuantiTect Whole Transcriptome Kit含有逆转录酶、DNA聚合酶和优化的缓冲液及试剂,可对一个RNA样本的所有转录本进行扩增。此试剂盒整合了经质量验证的REPLI-g技术,通过非偏向序列扩增来合成cDNA。REPLI-g扩增采用Multiple Displacement Amplification(MDA)技术,应用独特加工的DNA聚合酶实现等温扩增(参见"Whole transcriptome amplification")。该技术确保包括5’末端在内的所有转录区的同等扩增,从而获得可用于real-time PCR的足够多的cDNA。

Procedure
从总RNA开始经过3个步骤可获得大量代表了整个转录子的cDNA(参见"Procedure")。首先,应用优化的含有T-Script Enzyme的逆转录混合物(含有随机引物和oligo-dT引物)将RNA转录为cDNA。用高效的连接混合物连接,然后用基于经验证的REPLI-g技术的扩增混合物扩增cDNA。
Applications

QuantiTect Whole Transcriptome Kit制备的cDNA可用于QuantiFast或Rotor-Gene Kits进行的real-time PCR分析,且可以储存用于以后的分析,但不适用于微阵列分析。QIAGEN提供REPLI-g Kits and Service,用于小量或珍贵样品的全基因组扩增。扩增高度一致,具有最小的序列偏好,可制备适合于基因分型和Comparative Genome Hybridization等应用的DNA。

Features
Specifications
扩增 Whole total RNA
应用 Real-time PCR, gene expression analysis
最大上样量 5 µl total RNA
所需最小吸液量 1 µl
反应时间 5 hours or 11 hours
反应体积 50 µl
每次处理样本量;通量 Mid
总RNA起始量 >10 ng purified total RNA
起始材料 Purified total RNA
技术 Reverse transcription followed by ligation and multiple displacement amplification (MDA)
产量 10 µg or 40 µg cDNA

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常见问题 (25)
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试剂盒操作手册 (1)
For preparation of cDNA from total RNA by whole transcriptome amplification
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