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QuantiTect Reverse Transcription Kit

快速合成cDNA,进行两步法real-time RT-PCR,用于基因表达分析

  • cDNA合成和gDNA去除仅用20分钟完成
  • 即便是低丰度的转录本也能获得高产量的cDNA
  • 转录本的5'和3'端区域都可以进行cDNA合成
  • 无需设计RNA特异性引物或探针

QuantiTect Reverse Transcription Kit通过方便快速的操作过程进行cDNA合成,并有效去除基因组DNA。应用gDNA Wipeout Buffer可高效去除RNA样本中的基因组DNA污染。QuantiTect Reverse Transcription Kit提供所有快速、高效逆转录所需的组分,包括Quantiscript Reverse Transcriptase、Quantiscript RT Buffer和独特的RT Primer Mix。合成的cDNA经过优化可用于real-time PCR,实现对mRNA转录本所有区域的靶分子进行可靠的定量检测。

Cat No./ID: 205310
QuantiTect Rev. Transcription Kit (10)
Trial kit for 10 x 20 µl reactions: 100 µl 7x gDNA Wipeout Buffer, 10 µl Quantiscript Reverse Transcriptase, 200 µl 5x Quantiscript RT Buffer, 50 µl RT Primer Mix, 1.9 ml RNase-Free Water
Cat No./ID: 205311
QuantiTect Rev. Transcription Kit (50)
For 50 x 20 µl reactions: 100 µl 7x gDNA Wipeout Buffer, 50 µl Quantiscript Reverse Transcriptase, 200 µl 5x Quantiscript RT Buffer, 50 µl RT Primer Mix, 1.9 ml RNase-Free Water
Cat No./ID: 205313
QuantiTect Rev. Transcription Kit (200)
For 200 x 20 µl reactions: 4 x 100 µl 7x gDNA Wipeout Buffer, 4 x 50 µl Quantiscript Reverse Transcriptase, 4 x 200 µl 5x Quantiscript RT Buffer, 4 x 50 µl RT Primer Mix, 4 x 1.9 ml RNase-Free Water
Cat No./ID: 205314
QuantiTect Rev. Transcription Kit (400)
For 400 x 20 µl reactions: 800 µl 7x gDNA Wipeout Buffer, 400 µl Quantiscript Reverse Transcriptase, 1.6 ml 5x Quantiscript RT Buffer, 400 µl RT Primer Mix, 8 x 1.9 ml RNase-Free Water

QuantiTect Reverse Transcription Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0
快速、便利的cDNA合成。
使用QuantiTect Reverse Transcription Kit,只需20分钟即可完成基因组DNA去除和cDNA合成。由于上述反应均采用相同的孵育温度且使用预混液构建,因此操作步骤十分快速便捷。而Supplier I的试剂盒的操作步骤则长很多,它具有其他移液步骤且频繁改变孵育温度,因此需要更多的“操作时间”。
1
高效去除基因组DNA,获得准确的real-time RT-PCR。
使用 (+RT) 或不使用 (–RT) 逆转录酶,对β-actin进行两步法real-time RT-PCR。利用100 ng总RNA合成cDNA,在LightCycler 2.0上使用QuantiTect SYBR® Green PCR Kit进行real-time PCR,重复两次。利用β-actin特异性引物检测mRNA和基因组DNA序列。同时进行无模板对照反应 (绿色)。[A] 使用QuantiTect Reverse Transcription Kit进行RT步骤。红色的平直–RT曲线表示有效去除了残留基因组DNA。[B] 使用Supplier I (Enzyme SIII) 的试剂盒进行逆转录步骤。紫色的–RT曲线表示残留基因组DNA扩增。
2
灵敏检测5'端12.5 kb的转录本。
位于小鼠抗肌萎缩蛋白基因5'区域的靶点(poly-A位点上游约12.5 kb)的两步法real-time RT-PCR。使用QuantiTect Reverse Transcription Kit及Supplier I和Supplier R提供的逆转录酶,对从小鼠睾丸中纯化的总RNA进行逆转录。在LightCycler系统上采用real-time PCR分析相同体积的三次重复的逆转录反应。误差条显示了三次重复反应的标准差。与其他两个试剂盒相比,QuantiTect Reverse Transcription Kit可生成更多的cDNA(表现为较低的CT值),并且real-time RT-PCR的可重复性更高(表现为更小的误差范围)。RFU:相对荧光单位。
(数据由德国汉堡大学医院分子男科学系的Andrej-Nikolai Spiess博士提供。)
3
两步法real-time RT-PCR具有高灵敏性。
[A] TGFB2(低表达)和 [B] IL8(高表达)的两步法real-time RT-PCR分析。使用PAXgene Blood RNA系统从人全血中纯化总RNA。然后使用QuantiTect Reverse Transcription Kit、Supplier AII的试剂盒或Supplier I的试剂盒从1 µg RNA中合成cDNA。在ABI PRISM 7900上使用QuantiTect Probe PCR Kit及针对TGFB2或IL8的QuantiTect Gene Expression Assay进行real-time PCR,重复两次。使用QuantiTect Reverse Transcription Kit扩增TGFB2,获得最低的CT值,证明即便是低丰度的基因亦可高效逆转录,并在real-time PCR中实现灵敏的检测。
Performance

使用QuantiTect Reverse Transcription Kit,基因组DNA污染物可使用独特的gDNA Wipeout Buffer迅速有效的去除(参见"Effective genomic DNA removal for accurate real-time RT-PCR")。去除基因组DNA对于准确的基因表达结果非常重要,而并不总是可以设计RNA特异性引物或探针。使用gDNA Wipeout Buffer可节省时间和费用,因为纯化RNA样品过程中或纯化后均无需另外采用DNase消化。

Quantiscript Reverse Transcriptase的高RNA亲和性配合Quantiscript RT Buffer可从各种RNA模板中获得高产量cDNA(见表“低丰度转录本可获得较高产量的cDNA”)。即使复杂的模板也能成功逆转录,如GC含量高或有复杂二级结构的模板。

低丰度转录本可获得较高产量的cDNA
IL12A的CT
(低表达)
IL1RN的CT
(高表达)
Input RNA (ng) QIAGEN Supplier AII QIAGEN Supplier AII
1000 30.9 32.0 23.1 24.9
100 34.2 35.4 26.3 26.6
10 37.8 46.8 29.7 30.3
1 N.D. N.D. 32.4 34.5
使用不同量的RNA对IL12A和IL1RN 进行两步法Real-time RT-PCR分析。使用 QuantiTect Reverse Transcription Kit或是来自Supplier AII的试剂盒对总RNA逆转录。在ABI PRISM 7900上使用QuantiTect Probe PCR Kit对合成的cDNA进行分析,运用QuantiTect Gene Expression Assays分析IL12A或IL1RN。QIAGEN试剂盒得到的CT值更低,特别是培养基丰富的IL12A基因(加粗),表明cDNA产量更高。N.D.: Not detected.

RT Primer Mix包含有特别优化的oligo-dT和随机引物的混合物,使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始,甚至可从5'区域开始(参见"Sensitive detection of a target at the 5' region of a 12.5 kb transcript")。与其他供应商提供的试剂盒相比,QuantiTect Reverse Transcription Kit为real-time PCR分析提供高产量的cDNA,无需考虑待扩增目标序列位于转录本的哪个区域,检测低丰度的基因也具有更高灵敏度(参见"Higher sensitivity in real-time, two-step RT-PCR")。同时,QuantiTect Reverse Transcription Kit也确保了real-time RT-PCR结果更好的重复性。

Principle

QuantiTect Reverse Transcriptase是Omniscript和Sensiscript Reverse Transcriptases的新型混合物,对RNA具有高亲和性,可从各种含量的RNA(10 pg到1 µg)合成cDNA。与其他供应商提供的试剂盒相比,QuantiTect Reverse Transcription Kit为real-time PCR分析提供高产量的cDNA,无需考虑待扩增目标序列位于转录本的哪个区域。即使复杂的模板也能成功逆转录,如GC含量高或有复杂二级结构的模板。QuantiTect RT Buffer已经过优化,可与real-time PCR缓冲液兼容。

为获得准确的real-time RT-PCR基因表达分析结果,很重要的是仅扩增和检测cDNA。基因组DNA的干扰可通过设计横跨外显子/外显子边界的引物或探针避免。尽管如此,在某些特殊情况下(如:cDNA来自一个单外显子基因),起始RNA样品必须无基因组DNA。使用QuantiTect Reverse Transcription Kit,基因组DNA污染物可使用独特的gDNA Wipeout Buffer迅速有效的去除。使用gDNA Wipeout Buffer可节省时间和费用,因为纯化RNA样品过程中或纯化后均无需另外采用DNase消化。另外,不需要设计RNA特异性引物或探针。

QuantiTect Reverse Transcriptase Kit的组份
组份优势
gDNA Wipeout Buffer 在real-time RT-PCR时仅检测RNA
Quantiscript Reverse Transcriptase 适用的RNA起始量范围大(10 pg到1 µg RNA)
灵敏度高
Quantiscript RT Buffer 处理复杂模板
RT Primer Mix 对转录本的各个区域,包括5'区进行cDNA合成
Procedure

使用QuantiTect Reverse Transcription Kit可在20分钟内去除基因组DNA和合成cDNA(参见"Fast and convenient cDNA synthesis")。由于两个反应均在同一孵育温度并使用预混液构建反应,因此操作过程快速且方便。

QuantiTect Reverse Transcription Kit包括快速合成cDNA所需的所有组分。纯化的RNA只需简单地与gDNA Wipeout Buffer孵育,即可有效去除污染的基因组DNA。与其他的方法相比,使用Quantiscript Reverse Transcriptase、Quantiscript RT Buffer和RT Primer Mix制备的预混液可将RNA样品直接进行逆转录。使用Quantiscript Reverse Transcriptase,即使具有复杂的二级结构的RNA也可在低温下转录,确保RNA保持完整:整个反应都在42°C下完成,并在95°C失活。不需要RNA变性、引物退火和RNase H消化。

Applications

QuantiTect Reverse Transcription Kit可从各种类型的起始样本中合成cDNA,以实现高效和高灵敏度的real-time RT-PCR。样本类型包括激光显微切割样本和活组织切片。

Features
Specifications
应用 Quantification of (even low-abundance) transcripts
酶活 Reverse transcription
预混液 No
反应类型 Two-step, cDNA production, genomic DNA digestion
real-time或终点法PCR Real time
样本/目标类型 RNA template
单一或多重 Single

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试剂盒操作手册 (1)
For cDNA synthesis with integrated removal of genomic DNA contamination For use in real-time two-step RT-PCR
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