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QuantiTect Multiplex PCR Kits

使用序列特异性探针进行两步法多重定量RT-PCR,用于基因表达分析

  • 无需优化的多重PCR分析
  • 单次反应分析多个目标序列
  • 灵敏地检测低至10个拷贝的目标序列
  • 可靠的定量检测目标序列和对照基因

QuantiTect Multiplex PCR Kit可通过多重两步法real-time PCR在单管中对5个cDNA进行可靠的定量检测。即用型预混液具有热启动和独特的PCR缓冲液体系,无需优化即可在各种real-time PCR仪上进行高度灵敏、可靠的多重定量PCR。dNTP混合液含有dUTP,可选择性进行UNG处理。该试剂盒有两种规格:QuantiTect Multiplex PCR Kit适用于需要ROX染料进行荧光校正的PCR仪,QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit适用于其他PCR仪。为便于使用,预混液可储存在2–8°C。

Cat No./ID: 204541
QuantiTect Multiplex PCR Kit (40)
Trial kit for 40 x 50 µl reactions: 1 ml 2x QuantiTect Multiplex PCR Master Mix (with ROX dye), 2 ml RNase-Free Water
Cat No./ID: 204543
QuantiTect Multiplex PCR Kit (200)
For 200 x 50 µl reactions: 3 x 1.7 ml 2x QuantiTect Multiplex PCR Master Mix (with ROX dye), 2 x 2 ml RNase-Free Water
Cat No./ID: 204545
QuantiTect Multiplex PCR Kit (1000)
For 1000 x 50 µl reactions: 25 ml 2x QuantiTect Multiplex PCR Master Mix (with ROX dye), 20 ml RNase-Free Water
Cat No./ID: 204741
QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit (40)
Trial kit for 40 x 50 µl reactions: 1 ml 2x QuantiTect Multiplex PCR NoROX Master Mix (without ROX dye), 2 ml RNase-Free Water
Cat No./ID: 204743
QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit (200)
For 200 x 50 µl reactions: 3 x 1.7 ml 2x QuantiTect Multiplex PCR NoROX Master Mix (without ROX dye), 2 x 2 ml RNase-Free Water
Cat No./ID: 204745
QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit (1000)
For 1000 x 50 µl reactions: 25 ml 2x QuantiTect Multiplex PCR NoROX Master Mix (without ROX dye), 20 ml RNase-Free Water

QuantiTect Multiplex PCR Kits适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0
三重PCR和单重PCR获得的CT值相当。
在iCycler iQ上利用三重PCR (彩色曲线) 和单重PCR (灰色曲线) 分析稀释的cDNA模板 (100 ng、11.11 ng、1.23 ng和0.14 ng)。使用FAM、HEX或Cyanine 670染料标记的TaqMan探针。(数据由美国明尼苏达州明尼阿波利斯的明尼苏达大学提供。)
1
四重PCR和单重PCR的结果相当。
在Rotor-Gene 3000上使用QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit,利用4重PCR或单重PCR扩增GAPDH、18S、HSP和H28S序列。模板为100、10、1和0.1 ng的人白细胞cDNA。反应重复三次。使用FAM、HEX、Texas Red或Cyanine 670染料标记的TaqMan探针。扩增曲线上显示了4重PCR和单重PCR数据,其中单重PCR曲线为灰色。曲线显示了在较宽的模板量范围内可靠的多重定量,且在各组反应中具有极佳的可重复性。GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶;18S:18S rRNA;HSP:一种热休克蛋白;H28S:28S rRNA。
2
对低丰度和高丰度靶基因进行成功的三重qPCR。
在LightCycler 2.0系统上使用QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit,利用三重PCR或单重PCR扩增三种序列 (CSBG、GAPDH和HSP)。制备包含不同量的人基因组DNA (用于CSBG扩增)、线性化质粒 (用于GAPDH扩增) 和人白细胞cDNA (用于HSP扩增) 的三种模板混合物。反应重复两次。使用FAM、HEX或Texas Red染料标记的TaqMan探针。扩增曲线显示了利用三重PCR对CSBG的检测 (蓝色:1400个拷贝;绿色:140个拷贝;红色:14个拷贝)。
3
成功检测10个拷贝的靶基因。
[A] 在ABI PRISM 7700上使用QuantiTect Multiplex PCR Kit或Supplier AII的试剂盒进行双重PCR。对不同量的t (8;14) 易位序列 (50,000、5000、500、50或10个拷贝) 及恒定量的GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶) 序列 (107个拷贝) 进行共扩增。使用FAM标记的TaqMan探针从Ramos细胞系基因组DNA中扩增t (8;14) 易位序列。使用HEX标记的TaqMan探针从包含GAPDH cDNA序列的质粒中扩增GAPDH序列。与Supplier AII的试剂盒相比,QuantiTect Multiplex PCR Kit可在大量 (107个拷贝) GAPDH序列存在的条件下,实现从大量到少量的t (8;14) 易位序列 (低至10个拷贝,以箭头标示) 的可靠定量。[B] 重复 [A] 所述的步骤,利用单重PCR单独扩增目标序列除外。
Performance

QuantiTect Multiplex PCR Master Mix确保在多重扩增反应液中PCR产物扩增的效率和灵敏度与单一扩增反应中相同(参见“三重和单一PCR反应的CΤ值比较”、"Comparable results with 4-plex and singleplex PCRs"和"Equivalent CT values in triplex PCR and singleplex PCR")。

三重和单一PCR反应的CΤ值比较
检测t(8;14) 易位序列(20拷贝) 检测GAPDH cDNA序列(106拷贝) 检测NFKB cDNA序列(拷贝数参见第一栏)
105拷贝NFKB的三重PCR 34.31 20.37 21.92
相应的单一PCR 34.07 20.54 21.83
拷贝NFKB的三重PCR 34.61 20.62 25.03
相应的单一PCR 34.00 20.46 25.19
103拷贝NFKB的三重PCR 35.17 19.94 28.38
相应的单一PCR 34.43 20.50 28.65
在ABI PRISM 7900上使用QuantiTect Multiplex PCR Kit对三个序列进行三重或单重PCR扩增。模板是来自Ramos细胞系的140 pg基因组DNA,并带有t(8;14)的易位(目标序列约20个拷贝);106拷贝数的含有人GADPH cDNA序列的线性质粒;105、104或103 拷贝数的含有人NFKB cDNA序列的质粒。通过一次实验模拟了对少量、大量和不同量的靶基因的定量检测。使用了标记有FAM、HEX或Bodipy TMR报告染料及BHQ淬灭序列的TaqMan探针。

此试剂盒可检测低至10个拷贝数的靶基因,即使同一反应液中对照基因的拷贝数是106倍以上(参见"Detection of 10 copies of target gene with excess reference gene"、"Successful quantitative triplex qPCR of low and high abundance targets"和“对高和低丰度靶基因的进行成功的三重real-time PCR检测”)。

对高和低丰度靶基因的进行成功的三重real-time PCR检测
检测CSBG 检测GAPDH 检测HSP
模板预混液1 1400拷贝 106拷贝 2 x 104拷贝
三重PCR的CT 27.73 18.69 23.59
单一PCR的CT 27.08 18.89 23.52
模板预混液2 140拷贝 106拷贝 2 x 103拷贝
三重PCR的CT 31.11 19.00 27.05
单一PCR的CT 30.66 18.61 26.97
模板预混液3 14拷贝 106拷贝 2 x 102拷贝
三重PCR的CT 34.74 18.98 30.71
单一PCR的CT 33.84 19.01 30.38
在LightCycler 2.0系统上使用QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit对三个序列(CSBG、GAPDH和HSP)进行了三重或多重PCR扩增。三种模板混有不同含量的人基因组DNA(用于CSBG扩增)、线性质粒(用于GADPH扩增)和人白细胞cDNA(用于HSP扩增)。反应含有两个平行。 TaqMan探针标记有FAM、HEX或Texas Red染料。表中显示了大约的目标序列拷贝数和三重及单重PCR的CT值。数据表明,在存在大量(106拷贝)GADPH序列的情况下检测少至14拷贝的CSBG序列,三重和单重PCR具有相当的CΤ值。CSBG:假丝酵母溶解β-葡聚糖;GADPH:甘油三磷酸脱氢酶;HSP:热激蛋白
Principle

使用QuantiTect Multiplex PCR Kit可确保两步法多重RT-PCR反应的成功(参见"QIAGEN multiplex kits")。优化的预混液确保PCR产物在多重反应中的扩增效率和灵敏度与在单一反应中相同。此试剂盒可检测低至10个拷贝的靶基因。

在同一反应液中扩增对照和靶基因,可减少操作误差,提高基因定量分析的可靠性。QuantiTect Multiplex PCR Master Mix含有浓度平衡的K+、NH4+和独特合成的MP因子,可促使引物和探针与核酸模板稳定、高效的退火,提高PCR效率(参见"Unique PCR buffer")。此外,HotStarTaq Plus DNA Polymerase具有严谨的热启动,可防止非特异性产物的形成。

QuantiTect Multiplex PCR Master Mix含有dUTP,可在PCR前使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)预处理,保证被污染的PCR产物不会影响后续的PCR反应。

QuantiTect Multiplex PCR Kit的组分
组分 特点 优势
HotStarTaq DNA Polymerase 在95ºC下15分钟即可活化 在室温下构建qPCR反应
QuantiTect Multiplex PCR Buffer 比例平衡的NH4+和K+ 特异性引物退火,确保可靠的PCR结果
Synthetic Factor MP 在同一管中对至多4个基因进行可靠的多重分析
dNTP混合液 包含dUTP,部分替代dTTP,可选用UNG处理 选用UNG处理,可消除PCR产物残留污染
ROX染料* 在Applied Biosystems或Agilent仪器上可标准化荧光信号 在需要ROX染料的循环仪上准确定量。不干扰在其他real-time循环仪上的反应。
* 如需查看预混液中是否很有ROX染料,请参见"Choosing the right QuantiTect Multiplex PCR Kit"。
Procedure

QuantiTect Multiplex PCR Kit含有即用型预混液,无需对反应液和循环条件进行优化。操作手册提供了适用于各种real-time PCR仪的实验方案,并列有推荐的染料。如果需要,反应液可用尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)(不提供)预处理,以去除之前反应残留的PCR产物。

可选预混液中含或不含ROX染料的试剂盒,确保能在各种real-time PCR仪上使用(见表)。ROX浓度已优化,可通过自动数据分析对低拷贝数进行检测。

选择合适的QuantiTect Multiplex PCR Kit
ROX染料 试剂盒兼容的循环仪
预混液中含有 QuantiTect Multiplex PCR Kit Applied Biosystems的循环仪
预混液中不含 QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit Rotor-Gene系列循环仪,Bio-Rad、Cepheid、Eppendorf、Roche、Agilent和其他供应商的循环仪

我们推荐使用QuantiTect Reverse Transcription Kit合成cDNA,可在两步法real-time RT-PCR中获得出色结果。该试剂盒可在20分钟内快速合成cDNA,并去除基因组DNA污染。

Applications

QuantiTect Multiplex PCR Kit可在各种real-time PCR仪上对cDNA进行基因表达分析,包括Applied Biosystems、Bio-Rad、Cepheid、Eppendorf、Roche和Agilent的仪器。在Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR分析仪上使用时,我们推荐使用专为快速PCR研发的Rotor-Gene Multiplex PCR Kit。

Features
Specifications
应用 Quantification of cDNA or genomic DNA targets
反应类型 PCR product amplification
real-time或终点法PCR Real-time
样本/目标类型 cDNA, DNA
单一或多重 Multiplex
SYBR Green I或序列特异性探针 Sequence-specific probes
热循环仪 Most real-time cyclers (e.g. LC, RG, ABI)
有/无ROX With ROX or without

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