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miScript PreAMP PCR Kit

Real-time PCR分析miRNA之前,预扩增从含少量RNA的样本中获得的cDNA

  • 有限的RNA进行miRNA表达分析的突破技术
  • 无偏差、可重复性结果
  • 可靠的工作流程
  • 完全整合入miScript PCR System工作流程

miScript PreAMP PCR Kit能够预扩增含少量RNA的起始样本,用于miScript PCR System miRNA的定量。miScript PreAMP PCR Kit使用多功能的、基于PCR的预扩增技术,在一个反应中预扩增400个miRNA特异性cDNA靶点。miScript PreAMP PCR Kit配合miScript PreAMP Primer Mixes,能够准确而全面对10 ng总RNA进行表达分析。10 ng的合成cDNA可以作为10个预扩增反应的模板。这样就提供了足够的模板用于多种Pathway-Focused miScript miRNA PCR Arrays或多种重复的miRNome miScript miRNA PCR Array,取决于使用的miScript PreAMP Primer Mix。

Cat No./ID: 331451
miScript PreAMP PCR Kit (12)
For 12 preamplification reactions: 5x miScript PreAMP Buffer, HotStarTaq DNA Polymerase (2 U/µl), miScript PreAMP Universal Primer, miR-16 miScript Primer Assay, SNORD95 miScript Primer Assay, miRNA reverse transcription control (miRTC), C. elegans miR-39 miScript Primer Assay, RNase-Free Water
Cat No./ID: 331452
miScript PreAMP PCR Kit (60)
For 60 preamplification reactions: 5x miScript PreAMP Buffer, HotStarTaq DNA Polymerase (2 U/µl), miScript PreAMP Universal Primer, miR-16 miScript Primer Assay, SNORD95 miScript Primer Assay, miRNA reverse transcription control (miRTC), C. elegans miR-39 miScript Primer Assay, RNase-Free Water

miScript PreAMP PCR Kit适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


0
较原来少10倍的起始cDNA在血清中预扩增后即可检测到两倍miRNA。
使用miRNeasy Serum/Plasma Kit从5 µl人血清中纯化总RNA。然后使用miScript II RT Kit及miScript HiSpec Buffer从0.7 µl血清等效物(SE)中制备cDNA。使用cDNA(0.7 µl SE)直接进行miRNA谱分析,或者先取十分之一的cDNA制备物(0.07 µl SE),使用miScript PreAMP PCR Kit及Serum & Plasma miScript PreAMP Pathway Primer Mix对其进行预扩增,然后再进行谱分析。使用Plasma & Serum miScript miRNA PCR Array进行miRNA谱分析。[A] 平均CT值和 [B] 检测的miRNA数的曲线显示,进行预扩增后,只需较原来少10倍的起始cDNA即可获得出色的结果。
1
重复性高。
使用miScript II RT Kit及miScript HiSpec Buffer,从人通用对照RNA样本中制备cDNA。三位不同的用户使用miScript PreAMP PCR Kit和miFinder miScript PreAMP Pathway Primer Mix进行预扩增。采用miFinder miScript miRNA PCR Array,对预扩增的cDNA进行miRNA谱分析,重复两次。在 [A] 散点图上比较CT值或者 [B] 绘制全部3位用户的CT值,可观察到不同用户之间的高度相关性。
2
使用比原来少1000倍的起始cDNA进行预扩增,FFPE样本中的表达谱被很好保留。
使用来自同一制备样本的预扩增cDNA和未预扩增cDNA进行miRNA谱分析。正常切片和肿瘤切片的x倍表达变化计算(2-ΔΔCT)散点图证明了未预扩增和预扩增样本之间的高相关水平。使用 [A] 96-plex miFinder miScript PreAMP Pathway Primer Mix和Array或 [B] 384-plex miScript PreAMP miRNome Primer Mix和Array。使用miRNeasy FFPE Kit,从正常肺组织和肺肿瘤组织5 µM FFPE切片中纯化RNA。使用miScript II RT Kit及miScript HiSpec Buffer从10 ng总RNA中制备cDNA,并使用miScript PreAMP PCR Kit进行预扩增。
3
预扩增和非预扩增的FFPE样本的表达谱具有高度相关性。
使用来自同一制备样本的预扩增cDNA和未预扩增cDNA进行miRNA谱分析。正常切片和肿瘤切片的ΔCT值(采用看家基因对照进行标准化)散点图证明了未预扩增和预扩增样本之间的高相关水平。使用 [A] 96-plex miFinder miScript PreAMP Pathway Primer Mix和Array或 [B] 384-plex miScript PreAMP miRNome Primer Mix和Array。使用miRNeasy FFPE Kit,从正常肺组织和肺肿瘤组织5 µM FFPE切片中纯化RNA。使用miScript II RT Kit及miScript HiSpec Buffer从10 ng总RNA中制备cDNA,并使用miScript PreAMP PCR Kit进行预扩增。
Performance
从非常有限量的样本中获得有意义的数据

miScript PreAMP PCR Kit提供了从小样本和RNA含量非常低的样本中获得大量可靠的miRNA谱分析数据的机会。先前不可能的样本现在也可获得关于miRNA表达和功能的宝贵信息。预扩增后,使用Serum & Plasma miScript miRNA PCR Array,少于1 µl血清中的RNA就可获得可靠的miRNA表达谱。

与未扩增样本结果的高度相关性

由miScript PreAMP PCR Kit可靠、无偏差的扩增后获得的数据与未扩增样本的结果有高度的相关性,这样确保了结果的可信度。比较肿瘤和正常肺组织FFPE样本miRNA表达谱的结果,也证明了其高度的相关性(参见"Preamplification preserves expression patterns in FFPE samples using 1000 fold less input cDNA"和"Extremely high correlation of expression between preamplified and nonpreamplified FFPE samples")。

可重复的结果和可靠的操作流程

使用miScript PreAMP PCR Kit进行预扩增非常可靠,确保获得一致、可重复的结果。即使是不同的实验者进行预扩增和miRNA表达谱实验,也可获得高度重复的结果(参见"High technical reproducibility")。

Principle

miScript PCR System配合SYBR® Green real-time PCR能够灵敏、特异性的进行miRNA定量和分析。miScript PCR System可以完成从RNA中合成cDNA和后续的real-time PCR检测miRNAs涉及的所有步骤。miScript PreAMP PCR Kit是miScript PCR System的一部分,使得研究者能够使用非常有限量的起始RNA进行miRNA分析实验(参见Janas, M.M. et al. (2012) Reduced Expression of Ribosomal Proteins Relieves MicroRNA-Mediated Repression. Molecular Cell 46, 171.)。这对RNA含量较少的样本是非常必要的,如体液、福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本以及细胞量较少的样本,如激光捕获显微切割(LCM)样本、流式分选细胞、循环肿瘤细胞和细针穿刺活检样本额。小样本中获得的少量RNA通常不足够进行可靠的miRNA分析实验,即使使用如real-time RT-PCR等灵敏的技术。

miScript PreAMP PCR Kit配合miScript PreAMP Primer Mixes能够对10 ng总RNA进行准确全面地表达分析,是一项重大的技术突破。10 ng的合成cDNA可以作为10个预扩增反应的模板。这样就提供了足够的模板用于多种Pathway-Focused miScript miRNA PCR Arrays或多种重复的miRNome miScript miRNA PCR Array,取决于使用的miScript PreAMP Primer Mix。miScript PreAMP PCR Kit使用多功能的、基于PCR的预扩增技术,在一个反应中预扩增400个miRNA特异性cDNA靶点。一般情况下,不论是96-plex或384-plex反应都能扩增2000–4000倍。

Procedure

少量RNA样本获得miRNA表达谱需要3个步骤:使用miScript II RT Kit进行逆转录,使用miScript PreAMP PCR Kit和miScript PreAMP Primer Mix进行预扩增,以及使用相应的miScript miRNA PCR Array和miScript SYBR Green PCR Kit进行real-time PCR。将miScript PreAMP PCR Kit和miScript PreAMP Primer Mix的预扩增整合入miScript PCR System miRNA表达谱的工作流程,确保了实验方案的可靠性和结果的可靠性和可重复性。

miScript PreAMP Primer Mixes适用于所有miScript miRNA PCR Arrays。也可使用miScript PreAMP PCR Kit配合25个miScript Primer Assays混合液进行预扩增。

预扩增质控

miScript PreAMP PCR Kit包括4个miScript Primer Assays用于预扩增质控实验,用来检验预扩增的cDNA。下表列出了质控和它们的作用。如需获得更多的详细信息,请参考miScript PreAMP Handbook

质控 作用
miR-16 miScript Primer Assay 确定预扩增cDNA的优化稀释因子,如果不知道模板的起始量
SNORD95 miScript Primer Assay 使用相对定量∆∆CT法将组织和细胞样本的数据标准
确定预扩增cDNA的优化稀释因子,如果不知道模板的起始量,且无miR-16
C. elegans miR-39 miScript Primer Assay 测量miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control(如果纯化过程中加入),用于确定血清和血浆样本的回收率
miRTC miScript Primer Assay 评估逆转录效率
Applications

miScript PreAMP PCR Kit作为miScript PCR System的一部分,用于:

  • 成熟miRNA的定量和谱分析
  • 从血清或血浆中发现生物标记物

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产品介绍与指南 (1)
Simultaneously profile mRNA, miRNA and lncRNA using a simple, complete workflow
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试剂盒操作手册 (3)

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For SYBR Green-based, real-time PCR profiling of microRNAs using pathway-focused arrays, HC arrays, and miRNome arrays
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For preamplification of cDNA from samples containing low RNA amounts prior to real-time PCR analysis of microRNA
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