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miScript PCR Controls

用于人类、小鼠、大鼠和狗miRNA的real-time PCR实验结果标准化

  • 适用于人类、小鼠、大鼠和狗
  • 高效率扩增,接近100%
  • miRNA在不同细胞和组织中稳定表达
  • 可通过GeneGlobe便利的订购
为确保miRNA real-time PCR分析获得准确、可重复性的结果,必须通过使用合适的内参RNA对靶基因miRNA的量进行标准化,即相对定量分析。在使用miScript PCR System进行miRNA定量分析中,miScript PCR Controls是内参的引物,使得结果标准化。miScript PCR Controls提供一组5个 snoRNAs(SNORD61、SNORD68、SNORD72、SNORD95和SNORD96A)及snRNA RNU6B(RNU6-2)。这些内参的设计参考了人类、小鼠、大鼠和狗中的序列同源性,同一个参照可用于4个物种。也可在GeneGlobe上单独订购miScript PCR Control。
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miScript PCR Controls适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


1
RNA表达水平相似。
从各种 [A] 人、[B] 小鼠、[C] 大鼠和 [D] 狗组织中提取总RNA,使用6种miScript PCR Controls进行snoRNA/snRNA表达分析。CT值显示,在不同的组织类型中,各种RNA的表达水平极为类似。
Performance

miScript Primer Assays设计用于大量的ncRNAs,评估不同类型细胞和组织中靶向ncRNAs的扩增效率和表达水平变化。miScript PCR Controls根据人类、小鼠、大鼠和狗ncRNAs的序列保守性而设计,可用于这4个物种。6个ncRNAs的miScript Primer Assays作为miScript PCR Controls。它们满足下面的条件:

内参ncRNA靶基因在多种细胞和组织中,表达水平相对稳定(参见"Constant expression levels of RNAs targeted by miScript PCR Controls")
标准条件下,扩增效率接近100%
在人类、小鼠、大鼠和狗中性能相同,同一内参可用于4个物种,可灵活使用
Principle

为确保miRNA定量PCR分析获得准确、可重复性的结果,必须通过使用合适的内参RNA对靶基因miRNA的量进行标准化,这就是相对定量分析。这是一种重要的参照照,可校正那些可能导致定量不准确的因素。这些因素包括使用的RNA数量的不同、RNA降解的可能性或RNA样本中出现抑制剂和样本处理的差异。标准化也可用于不同实验和样本结果的直接对比。

良好的内参

miRNA 定量PCR实验中,标准化数据的理想内参RNA应具有以下特性:

研究中所有样本应保持稳定的表达水平
与正在研究的miRNA大小相似
具与正在研究的miRNA样本表达水平类似
在实验条件下不被调控
内参RNA和miRNA的引物具有相近的扩增效率(接近100%)

miScript PCR Controls符合上述条件,可在miScript PCR System上用ΔΔCT方法进行人类、小鼠、大鼠和狗在miRNA水平的相对定量计算。

miScript PCR Controls靶向作用于非编码RNAs

QIAGEN提供一系列的miScript Primer Assays靶向ncRNAs如snoRNAs和snRNAs。QIAGEN技术人员系统评估了用于多种ncRNA的一系列miScript Primer Assays,并选择了6个miScript PCR Controls,5个snoRNAs和一个snRNA(参见下表)。这些内参也存在于每个miScript miRNA PCR Array中(参见"miScript miRNA PCR Array layout for 96-well plates")。

表. miScript PCR Controls
miScript PCR Control的名称 ncRNA的官方标志 ncRNA的别名 ncRNA类型 是否在人、小鼠、大鼠和狗中表达
Hs_SNORD61_1 miScript Primer Assay SNORD61 snoRNA
Hs_SNORD68_1 miScript Primer Assay SNORD68 snoRNA
Hs_SNORD72_1 miScript Primer Assay SNORD72 snoRNA
Hs_SNORD95_1 miScript Primer Assay SNORD95 snoRNA
Hs_SNORD96A_1 miScript Primer Assay SNORD96A snoRNA
Hs_RNU6-2_1 miScript Primer Assay RNU6-2 RNU6B snRNA

注意:miScript II RT Kit包含2种缓冲液:miScript HiFlex Buffer和miScript HiSpec Buffer。下面是以前的miScript PCR Controls不能与使用miScript HiSpec Buffer制备的cDNA一起使用:
Hs_RNU1A_1 miScript Primer Assay
Hs_RNU5A_1 miScript Primer Assay
Hs_SNORD25_1 miScript Primer Assay
Hs_SCARNA17_1 miScript Primer Assay
Hs_SNORA73A_1 miScript Primer Assay
如需使用这些miScript PCR Controls,应使用miScript HiFlex Buffer制备cDNA。

如需使用miScript HiSpec Buffer或miScript HiFlex Buffer制备cDNA,推荐使用上述表格中列出的miScript PCR Controls。

Procedure
怎样选择miScript PCR Controls

为miRNA定量分析选择合适的miScript PCR Control,类似于为mRNA定量分析标准化选择合适的管家基因。对研究中的不同样本类型和不同的处理,有必要验证miScript PCR Control的靶向ncRNA在实验条件下不被调控。另外,要选择表达水平稳定和与miRNA靶基因丰度相似的miScript PCR Control。miScript PCR Control可在GeneGlobe Web门户网站上单独订购。同时提供全套的miScript miRNA PCR Arrays和miScript miRNA QC PCR Arrays。

ΔΔCT法用于相对定量

ΔΔCT法通常用于在miScript PCR System中进行相对定量。该方法主要是比较正常的CT值和实验样本CT值的差异。使用miRNA靶基因的引物(miScript Primer Assay)进行Real-time PCR,同时使用miScript PCR Control检测snoRNA或snRNA。miScript PCR Control得到的循环阈值(CT)用于标准化数据,如下所示。

首先,确定每个样本的循环阈值(CT)。然后,计算ΔCT。ΔCT即miRNA靶基因的CT值与内参ncRNA的CT值之差:
ΔCT = CT(miRNA靶基因)- CT(内参ncRNA)

下一步,计算ΔΔCT值和标准靶基因的表达:
ΔΔCT = ΔCT(样本[ 如疾病细胞])- ΔCT(校准值[如正常细胞])
样本中标准miRNA靶基因的表达= 2-ΔΔCT

最后,校准器中的标准表达水平设置为100%:
% 表达值的变化=(样本中标准miRNA靶基因的表达值x 100)% - 100%

miScript miRNA PCR Array数据分析

miScript miRNA PCR Array 数据分析工具,使用相对定量的∆∆CT法自动完成定量和进行内参分析。结果以表格、散点图、三维谱分析图和火山图(包括复本)的形式呈现。可单独订购其它分析工具,用于不同的miScript miRNA PCR Array,还可使用Web-based或Excel格式。

Applications

miScript PCR Controls适用于miRNA定量和表达谱分析

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产品介绍与指南 (2)
Simultaneously profile mRNA, miRNA and lncRNA using a simple, complete workflow
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试剂盒操作手册 (1)
For real-time PCR analysis of microRNA using SYBR Green detection
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