用于人类、小鼠、大鼠和狗miRNA的real-time PCR实验结果标准化

  • 适用于人类、小鼠、大鼠和狗
  • 高效率扩增,接近100%
  • miRNA在不同细胞和组织中稳定表达
  • 可通过GeneGlobe便利的订购
为确保miRNA real-time PCR分析获得准确、可重复性的结果,必须通过使用合适的内参RNA对靶基因miRNA的量进行标准化,即相对定量分析。在使用miScript PCR System进行miRNA定量分析中,miScript PCR Controls是内参的引物,使得结果标准化。miScript PCR Controls提供一组5个 snoRNAs(SNORD61、SNORD68、SNORD72、SNORD95和SNORD96A)及snRNA RNU6B(RNU6-2)。这些内参的设计参考了人类、小鼠、大鼠和狗中的序列同源性,同一个参照可用于4个物种。也可在GeneGlobe上单独订购miScript PCR Control。
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miScript PCR Controls are intended for molecular biology applications. These products are not intended for the diagnosis, prevention, or treatment of a disease.


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miScript miRNA PCR Array layout for 96-well plates.|Constant expression levels of RNAs targeted by miScript PCR Controls.|
Wells H3 to H8 each contain an assay for a different snoRNA/snRNA that can be used as a normalization control for the array data (SN1=SNORD61 assay, SN2=SNORD68 assay, SN3=SNORD72 assay, SN4=SNORD95 assay, SN5=SNORD96A assay, SN6=RNU6B/RNU6-2 assay). Wells H1 and H2 contain replicate C. elegans miR-39 miScript Primer Assays that can be used as an alternative normalizer for array data (Ce). Wells H9 and H10 contain replicate reverse transcription controls (miRTC). Wells H11 and H12 contain replicate positive PCR controls (PPC). These controls are also included in 384-well plate and Rotor-Disc 100 format miScript miRNA PCR Arrays.|Total RNA from various [A] human, [B] mouse, [C] rat, and [D] dog tissues was used for expression analysis of snoRNA/snRNA using 6 miScript PCR Controls. CT values show that the expression level of each RNA was very similar in different tissue types.|
Performance

miScript Primer Assays设计用于大量的ncRNAs,评估不同类型细胞和组织中靶向ncRNAs的扩增效率和表达水平变化。miScript PCR Controls根据人类、小鼠、大鼠和狗ncRNAs的序列保守性而设计,可用于这4个物种。6个ncRNAs的miScript Primer Assays作为miScript PCR Controls。它们满足下面的条件:

内参ncRNA靶基因在多种细胞和组织中,表达水平相对稳定(参见"Constant expression levels of RNAs targeted by miScript PCR Controls")
标准条件下,扩增效率接近100%
在人类、小鼠、大鼠和狗中性能相同,同一内参可用于4个物种,可灵活使用
Principle

为确保miRNA定量PCR分析获得准确、可重复性的结果,必须通过使用合适的内参RNA对靶基因miRNA的量进行标准化,这就是相对定量分析。这是一种重要的参照照,可校正那些可能导致定量不准确的因素。这些因素包括使用的RNA数量的不同、RNA降解的可能性或RNA样本中出现抑制剂和样本处理的差异。标准化也可用于不同实验和样本结果的直接对比。

良好的内参

miRNA 定量PCR实验中,标准化数据的理想内参RNA应具有以下特性:

研究中所有样本应保持稳定的表达水平
与正在研究的miRNA大小相似
具与正在研究的miRNA样本表达水平类似
在实验条件下不被调控
内参RNA和miRNA的引物具有相近的扩增效率(接近100%)

miScript PCR Controls符合上述条件,可在miScript PCR System上用ΔΔCT方法进行人类、小鼠、大鼠和狗在miRNA水平的相对定量计算。

miScript PCR Controls靶向作用于非编码RNAs

QIAGEN提供一系列的miScript Primer Assays靶向ncRNAs如snoRNAs和snRNAs。QIAGEN技术人员系统评估了用于多种ncRNA的一系列miScript Primer Assays,并选择了6个miScript PCR Controls,5个snoRNAs和一个snRNA(参见下表)。这些内参也存在于每个miScript miRNA PCR Array中(参见"miScript miRNA PCR Array layout for 96-well plates")。

表. miScript PCR Controls
miScript PCR Control的名称 ncRNA的官方标志 ncRNA的别名 ncRNA类型 是否在人、小鼠、大鼠和狗中表达
Hs_SNORD61_1 miScript Primer Assay SNORD61 snoRNA
Hs_SNORD68_1 miScript Primer Assay SNORD68 snoRNA
Hs_SNORD72_1 miScript Primer Assay SNORD72 snoRNA
Hs_SNORD95_1 miScript Primer Assay SNORD95 snoRNA
Hs_SNORD96A_1 miScript Primer Assay SNORD96A snoRNA
Hs_RNU6-2_1 miScript Primer Assay RNU6-2 RNU6B snRNA

注意:miScript II RT Kit包含2种缓冲液:miScript HiFlex Buffer和miScript HiSpec Buffer。下面是以前的miScript PCR Controls不能与使用miScript HiSpec Buffer制备的cDNA一起使用:
Hs_RNU1A_1 miScript Primer Assay
Hs_RNU5A_1 miScript Primer Assay
Hs_SNORD25_1 miScript Primer Assay
Hs_SCARNA17_1 miScript Primer Assay
Hs_SNORA73A_1 miScript Primer Assay
如需使用这些miScript PCR Controls,应使用miScript HiFlex Buffer制备cDNA。

如需使用miScript HiSpec Buffer或miScript HiFlex Buffer制备cDNA,推荐使用上述表格中列出的miScript PCR Controls。

Procedure
怎样选择miScript PCR Controls

为miRNA定量分析选择合适的miScript PCR Control,类似于为mRNA定量分析标准化选择合适的管家基因。对研究中的不同样本类型和不同的处理,有必要验证miScript PCR Control的靶向ncRNA在实验条件下不被调控。另外,要选择表达水平稳定和与miRNA靶基因丰度相似的miScript PCR Control。miScript PCR Control可在GeneGlobe Web门户网站上单独订购。同时提供全套的miScript miRNA PCR Arrays和miScript miRNA QC PCR Arrays。

ΔΔCT法用于相对定量

ΔΔCT法通常用于在miScript PCR System中进行相对定量。该方法主要是比较正常的CT值和实验样本CT值的差异。使用miRNA靶基因的引物(miScript Primer Assay)进行Real-time PCR,同时使用miScript PCR Control检测snoRNA或snRNA。miScript PCR Control得到的循环阈值(CT)用于标准化数据,如下所示。

首先,确定每个样本的循环阈值(CT)。然后,计算ΔCT。ΔCT即miRNA靶基因的CT值与内参ncRNA的CT值之差:
ΔCT = CT(miRNA靶基因)- CT(内参ncRNA)

下一步,计算ΔΔCT值和标准靶基因的表达:
ΔΔCT = ΔCT(样本[ 如疾病细胞])- ΔCT(校准值[如正常细胞])
样本中标准miRNA靶基因的表达= 2-ΔΔCT

最后,校准器中的标准表达水平设置为100%:
% 表达值的变化=(样本中标准miRNA靶基因的表达值x 100)% - 100%

miScript miRNA PCR Array数据分析

miScript miRNA PCR Array 数据分析工具,使用相对定量的∆∆CT法自动完成定量和进行内参分析。结果以表格、散点图、三维谱分析图和火山图(包括复本)的形式呈现。可单独订购其它分析工具,用于不同的miScript miRNA PCR Array,还可使用Web-based或Excel格式。

Applications

miScript PCR Controls适用于miRNA定量和表达谱分析

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Brochures & Guides
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