全基因组扩增(WGA)
实验方案和应用

全基因组扩增(WGA)实验方案和应用的概述
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全基因组扩增方法于1992年开发(1,2),是一种增加有限的DNA样本的数量的方法。法医和基因疾病研究中的DNA的量非常有限,又要进行多重分析应用,因此这种技术非常有用。目前已有很多种WGA技术问世,彼此之间在实验方案、扩增的准确程度和易用性方面存在差异。

 

基于PCR的全基因组扩增

有三种主要的基于PCR的WGA技术。它们分别是简并寡聚核苷酸PCR(DOP–PCR)(1),引物延伸预扩增(PEP)(2)或者相关的衍生方法,以及适配子连接PCR。这些技术之间的主要区别是,PEP技术使用预扩增步骤将引物结合位点加到DNA片段上去,以用于后续的WGA实验,而适配子连接PCR使用连接到DNA片段上的适配子做为PCR的引物结合位点。PEP技术使用随机的引物和较低的PCR退火温度。DOP–PCR技术使用半简并的寡聚核苷酸(即CGACTCGAGNNNNNNATGTGG)和较高的退火温度,但是这种技术目前已经很少使用了。在这两种技术中使用的Taq DNA聚合酶,将片段大小限制在3 kb(平均的片段大小是400–500个核苷酸大小),并且在序列中引入了很多错误。除此之外,已经发现这些技术不能完整地覆盖基因组,并且扩增是偏性的——在扩增的DNA中,一个序列的特定区域可能与引物优先结合而导致其被高估。

多重置换扩增WGA

多重置换扩增(MDA)使用随机六聚物与变性的DNA结合,然后在恒定的温度下,使用Phi29聚合酶进行链置换合成。在每一条被置换的链上发生的额外的引导事件,可能会产生分支DNA结构。

由于Phi29聚合酶不从基因组DNA模板上解离,使得生成的DNA片段能延长到100 kb左右,并且序列是无偏差的。这个酶具有3’–5’的核酸外切酶标定活性,其错误率比基于Taq DNA聚合酶的方法低大约1000倍。

基于PCR的WGA方法(比如,PEP和适配子连接PCR)会受到DNA二级结构的影响。这些结构会导致酶滑序(4)或者从模板上解离,从而导致出现非特异性的扩增产物,不能完整覆盖遗传位点和不能用于下游分析的短DNA片段(短于1 kb)(5)。与此相反,链置换聚合酶Phi29消除了DNA的二级结构,因而能够准确并且均匀的扩增基因组序列。使用高度续进性的Phi29聚合酶得到的长DNA片段,确保了Phi29扩增得到的DNA覆盖了整个基因组,连贯并且无偏地扩增所有遗传位点。

无偏差的扩增

使用高度续进性的Phi29聚合酶得到的长DNA片段确保了Phi29扩增得到的DNA覆盖了整个基因组,连贯并且无偏地扩增所有遗传位点。

在有偏的研究中,使用MDA、DOP–PCR和PEP技术对不同数量的基因组DNA进行扩增(0.3–300 ng)。使用定量检测real-time PCR确定8个遗传位点相对的表达量。通过与1 µg未扩增的对照DNA作比较,可以确定遗传位点的表达。

由于未消除的二级结构会导致不同位点的不等同扩增,基于PCR的WGA方法(比如DOP–PCR或者PEP)经常会导致遗传位点丢失。MDA具有最好的DNA扩增覆盖效果,并且将遗传位点丢失的风险降到了最低。

WGA中DNA变性的重要性

完整的长片段DNA能保证下游实验的高敏感性,是成功的WGA实验的理想模板。使用扩增的,片段化的DNA的实验,其敏感性和可靠性较差,这是由于靶标位点的DNA断裂风险增大。为了得到最佳的结果,模板DNA充分变性非常重要。但是在95°C条件下的热变性会损伤模板DNA,导致不完整的和连贯性较差的遗传位点呈递。碱性条件下的DNA变性回避了这些问题,以保证扩增覆盖整个基因组,并具有一致性和最低的序列偏倚。

应该避免DNA在95°C环境下的变性,因为这不仅会影响位点覆盖,而且会使Phi29从DNA模板上永久的解离下来,而影响MDA扩增得到的DNA产物的长度。通常而言,Phi29聚合酶能够复制长达100 kb的序列,而不从基因组DNA模板上解离下来。使用MDA扩增得到的DNA产物的大小的在2 kb至100 kb范围内,平均长度超过10 kb。因此,MDA扩增技术得到的DNA,对于需要长DNA片段的下游应用是非常理想的(比如RELP分析和Southern印迹)。

单细胞WGA

为了确保单细胞WGA使用了完整的基因组,应该在WGA反应中加入未受损的完整细胞。由于每一个DNA的断裂都会导致该位点的序列信息丢失,MDA是扩增整个基因组的最合适的方法。这一反应可用于全基因组扩增实验,是由于Phi29聚合酶能够复制长达100 kb的序列,而不从基因组DNA模板上解离下来。

在一项研究中,使用MDA技术扩增单个细胞的基因组DNA(3个复本)。在单细胞WGA实验中,大约产生了40 µg DNA。将单细胞WGA实验得到的DNA与1000个细胞的WGA实验得到的DNA,以及未扩增的全基因组测序DNA相比较。全基因组测序使用2 µg DNA,并使用illumina MiSeq仪器进行(WGA–DNA或者未扩增的基因组DNA)。gDNA和单细胞扩增的DNA具有相似的序列覆盖度。未扩增的和REPLI–g扩增的DNA具有非常低的,相似的错误率。

处理片段化的DNA

MDA技术要求基因组DNA片段的平均长度大约为2 kb,以便无偏差的扩增DNA。尽管可以将片段连接起来得到更长的DNA,只要一些DNA片段的长度大于2 kb,片段化的DNA和低质量的DNA也能使用。这是因为随机片段化的DNA包含了所有位点的多个无损的拷贝。但是为了保证对位点的精确覆盖,应该增加模板DNA的起始量。

处理固定的组织样本:FFPE组织中的DNA

福尔马林固定是在石蜡包埋(FFPE)中保存组织样本的最常用的技术。这种技术通过交联生物分子,确保组织的结构和细胞的形态被保留下来。不同的组织类型需要不同的固定流程:柔软连续的组织,比如乳房组织样本,通常需要较长的固定步骤以保存组织形态。更长的固定时间可能会导致两个结果:

  • 生物分子之间的交联程度更高
  • DNA的破碎程度更高——导致几百个碱基长度的小DNA片段

DNA的片段化减少了PCR可以检测到的基因组的量,因此对下游的实验具有很大影响。

尽管目前没有简单的方法能确定样本中的交联程度,对FFPE样本中分离出来的DNA进行凝胶电泳能给出关于DNA的质量的有价值的线索。

影响基于PCR的分析和后续的MDA实验的关键因素

使用PCR技术从石蜡包埋组织中检测特定的遗传位点受到以下因素的影响:

  • 拷贝数
  • 交联程度
  • 扩增子大小

拷贝数:DNA的量越多,基因组的拷贝数目也越多,经过整个基因组扩增之后,PCR检测到特定遗传位点位的可能性也就越大。但是,石蜡包埋样本中DNA的定量检测会受到与DNA共同分离出来的很多污染物的影响。使用紫外光扫描法能确定污染物。相反的,单独测定260 nm处的吸光度(A260),而不使用紫外光扫描(220到320 nm范围内的吸光度),会高估DNA的浓度。高估PCR或者其他下游实验中输入的DNA的量,可能会观察到比较差的结果。

交联:DNA样本的交联程度越高,扩增反应(比如全基因组扩增)的结果越差。

扩增子大小:基于PCR分析FFPE处理的DNA时,所用到的扩增子越小,检测到特定的遗传位点的可能性越大。完整的DNA的real-time PCR 实验与石蜡组织包埋的样本实验比较说明,增大扩增子会显著降低可检测的基因组的数量。

WGA应用

MDA技术扩增的全基因组DNA适用于:

  • 二代测序
  • 使用芯片进行基因分型检测
  • 比较基因组杂交研究(CGH)
  • 单核苷酸多态性(SNP)基因分型检测
  • Sanger测序
  • STR微卫星分析
  • 单体基因分型检测

参考文献

  1. Telenius, H., Carter, N.P., Bebb, C.E., et al. (1992) Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics 13, 718.
  2. Zhang, L., Cui, X., Schmitt, K., et al. (1992) Whole genome amplification from a single cell: Implications for genetic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5847.
  3. Rosenthal, A., and Jones, D.S. (1990) Genomic walking and sequencing by oligo-cassette mediated polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 18, 3095.
  4. Viguera, E., Canceill, D., Ehrlich, S.D. (2001) Replication slippage involves DNA polymerase pausing and dissociation. EMBO J. 20, 2587
  5. Dean, F.B. et al. (2002) Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5261.

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