适用于包括RNAi、siRNA、miRNA、模拟物和抑制物等RNA的实验方案和应用
  • Main Image Navi
本部分内容描述了,从不同的样品源中分离、定量检测及储存RNA时的注意事项,同时也包含了RNAi处理以及siRNA、miRNA、模拟物和抑制物使用说明。

 

何为RNA?

RNA是具有多种不同的功能的生物大分子。信使RNA(mRNA)是DNA转录得到的,用做蛋白质合成的模板。蛋白质的合成是由核糖体完成的,核糖体由核糖体RNA(rRNA)和蛋白质组成。用于蛋白合成的氨基酸,是通过转运RNA(tRNA)输送到核糖体上的。RNA分子也是参与RNA转运过程的核糖蛋白的一部分。非编码RNA也是非常重要的。它们是不翻译成蛋白质的功能RNA分子。这样的RNA分子包括tRNA、rRNA、核仁小RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA和piwi-interacting RNA(piRNA)。它们通常在基因表达的调控中发挥作用。

miRNA是一类内源性的(自然产生的),约18–24个核苷酸大小的非编码RNA,在转录后的基因调控中发挥作用。一个miRNA可能在每个细胞中有超过105个拷贝,但是从每个细胞中总RNA质量的角度来看,这些RNA又是微不足道的。由于它们非常短,因此通常需要特别的分离和分析方案。

一个典型的快速生长的哺乳动物细胞培养中,每个细胞大约含有10–30 pg的RNA,而一个完全分化的原代细胞中,RNA的量要少得多——大约每个细胞中RNA的含量小于1 pg。细胞中的RNA分子主要是tRNA和rRNA。mRNA大约占细胞中RNA总量的1–5%,但是具体的量取决于细胞类型和细胞的生理状态。一个动物细胞中,大约有360,000个mRNA分子,组成了大约12,000个转录本,一个典型转录本的长度大约为2 kb。一些mRNA分子占到了总mRNA的3%,而其它的mRNA分子的含量低于0.01%。这些“稀有的”或者“低丰度”的mRNA分子在每个细胞中只有5–15个拷贝。但是,这些稀有的mRNA大约有11,000种,占到了mRNA数量的45%。

一个生物体中的基因是相对固定的,因此,mRNA的组成代表了在给定的条件下,基因的表达方式。使用杂交技术,包括RNA印迹法(northern印迹)和微阵列分析,或RT-PCR技术、转录本测序技术(RNA-seq)对RNA进行分析,能够充分反映一个生物体中的基因表达谱。但是,与DNA相比,RNA相对不稳定。这很大程度上是由于存在会降解RNA分子的核糖核酸酶(RNases)。

核糖核酸酶非常的稳定,不需要辅因子,在非常低浓度的时候就有很高的催化效率,并且不容易失活。核糖核酸酶的污染可以来自于人类的皮肤和携带有细菌和霉菌的尘埃颗粒。因此,RNA的分离和分析需要特别的技术。

这部分描述了成功的RNA稳定,纯化和分析的流程。

一个典型人类细胞的RNA含量
参数
每个细胞中的总RNA <1–30 pg
细胞核中总RNA的比例 ~14%
细胞核中DNA:RNA ~2:1
mRNA分子 2 x 105 – 1 x 106
mRNA常规大小 1900 nt

 

在一个典型哺乳动物细胞中RNA的分布
RNA种类 相对的量
rRNA (28S, 18S, 5S) 80–85%
tRNAs, snRNAs, low MW species 15–20%
mRNAs 1–5%

 

基于丰度的mRNA分类
丰度 拷贝/细胞 每个细胞中不同mRNA的数量 每种mRNA的丰度
5–15 11,000 <0.004%
中等 200–400 500 <0.1%
12,000 <10 3%

 

不同细胞和组织中的RNA含量
器官 来源 总RNA (µg)*
细胞培养液 (1 x 106个细胞) NIH/3T3
HeLa
COS-7
LMH
Huh
10
15
35
12
15
小鼠/大鼠组织 (10 mg) 胚胎(13-day)



胸腺
25
20–30
40–60
30–40
40–50
10–20
酵母 (1 x 107个细胞) S. cerevisiae 25
植物 (100 mg叶片) 拟南芥
玉米
西红柿
番茄
35
25
65
60
* 由于物种、发育阶段和生长条件的不同,含量有可能不同。

microRNA

小RNA(miRNA)是一类内源性的(自然产生的),约22个核苷酸的非编码RNA分子,它们参与转录后的基因调控。它们与siRNA分子具有类似的特征。

miRNA分子在很多生物学过程中发挥了重要作用,包括细胞的分化和发育,细胞信号转导和对感染的应答等。大量的证据显示,miRNA表达的紊乱是一些疾病发生的原因和标志,包括多种癌症。在血清和血浆中可检测到无细胞的miRNA分子,而疾病会导致它们表达水平变化。这些发现,使得无细胞miRNA的表达很可能作为疾病诊断和预防中的生物标志物。

miRNA和siRNA的途径都与双链RNA相关,但是这些RNA分子的来源不同。与诱导RNA干扰的双链RNA不同,miRNA是由基因组编码的。除此之外,miRNA的前体(pre-miRNA)不完全是双链的,而是包含有双链区域的发卡结构。与RNAi不同(参考RNAi),miRNA的作用主要是调节细胞自己的基因。人类具有超过2000种miRNA分子,据估计,它们调节超过三分之二的人类基因。

miRNA系统是调节基因表达的内源性机制。成熟的miRNA分子,主要通过翻译抑制来调控内源性基因的表达。除此之外,miRNA能通过快速的脱腺苷化作用和去除帽子来摧毁mRNA。自然生成的miRNA分子的结合位点,通常在目标mRNA 3’端的非翻译区。在动物的miRNA分子中,序列的部分匹配给确定真正的结合位点带来困难,并且降低了结合位点确定的准确性。

miRNA模拟物和抑制剂

miRNA 模拟物是化学合成的,双链RNA分子(通常长度为18–24个核苷酸),通过转染到细胞中,模拟成熟的内源性miRNA分子。miRNA抑制剂是单链(通常长度为21–25个核苷酸),经过修饰的RNA分子,通过转染到细胞中,特异性的抑制miRNA的功能。模拟物和抑制剂包含一些化学修饰,以便提高活性或者增强其在体内的稳定性。

通过将miRNA模拟物转染到细胞中,并进行下游的基因表达分析或者表型分析,可以阐明特定miRNA分子的目标和发挥的作用。这些实验可以研究单个miRNA错误调节所造成的生物学影响,也能用于确定某个miRNA分子的特异性靶标基因。miRNA转染之后,如果降低或者提高基因的表达水平,说明研究的miRNA参与调节了这个基因的表达。类似的,miRNA在很多通路中的作用,都可以通过检测miRNA模拟物或者抑制剂转染之后的特定表型来研究。

miRNA模拟物/抑制剂转染对于下游应用的影响,通常可以通过如下方案来分析:

  • 携带有报告基因,比如荧光素酶,和一个或者多个位于3’端非翻译区的miRNA结合位点的质粒载体做为miRNA的靶标。miRNA的模拟物/抑制剂与载体共转染到细胞中。在转染之后,进行报告基因检测实验,比如荧光素酶检测实验。通过将上述转染的结果与只转染质粒载体的结果比较,确定miRNA模拟物和抑制剂的影响。
  • 将miRNA的模拟物/抑制剂转染到细胞中,然后检测相关的内源性基因(即所研究的miRNA分子的靶标)的表达。通过将结果与未转染的细胞或者转染了阴性对照的细胞的表达结果相比,可以确定miRNA模拟物/抑制剂的作用。由于miRNA通常抑制目标基因的翻译,而不降解目标基因的转录本,因此,一般通过检测蛋白的表达水平来确定基因的表达水平,比如通过蛋白质印迹法。这意味着miRNA模拟物/抑制剂的影响通常不能通过定量的real-time PCR 来检测。

siRNA和RNAi

siRNA

小干扰RNA(通常称做siRNA)参与多种生物学过程——最常见的是RNA干扰或者RNAi。

大多数RNA是单链的,但是,siRNA由两条互补的核酸链组成,与DNA类似。siRNA的长度大约为20–25个核苷酸。siRNA在RNAi过程中扮演了重要角色,它们通过互补的核苷酸序列来干扰特定基因的表达。

长度为21个核苷酸的双链siRNA分子的一些近似值:

  • 20 µM的siRNA相当于浓度大约为0.25 µg/µl
  • 长度为21个核苷酸的siRNA的分子量大约为13–15 µg/nmol
RNAi

RNA干扰(或者RNAi)是细胞中的一种自然发生的过程,它能够关闭或者沉默特定基因的活性。RNA干扰于1998年被发现,现在已经是研究基因功能的强大工具。

RNAi通过干扰信使RNA(mRNA)所携带的信息发挥作用,从而抑制蛋白的合成。mRNA失去活性,基因也就失活了。

诱导RNAi的双链RNA分子(siRNA),在进入细胞之后,被Dicer酶切割成小的片段。这些小的片段,作为引导物,引导siRNA与具有互补序列的mRNA相结合。然后,这些细胞内的mRNA被切割,从而有效地破坏了它们所携带的信息,并且沉默相应基因的表达。

RNAi的过程相当复杂。双链RNA被RNase III识别,然后切割成21–23个核苷酸大小的siRNA分子。这些siRNA分子参与组成了称做RISC(RNA-induced silencing complex,RNA 诱导的沉默复合物)的RNAi靶标复合物,这些复合物能够破坏与siRNA同源的mRNA分子。靶标mRNA分子在其与siRNA分子序列互补区域的中心处被切割,然后导致靶标mRNA分子被降解,降低了蛋白的表达。

使用siRNA

siRNA分子是RNAi过程中的主要效应因子,可以通过化学方法或者酶催化的方法在体外合成。siRNA的序列设计对于有效的基因沉默是非常关键的,它们的设计方法是基于对RNAi过程的理解,以及对天然存在的siRNA分子的功能的理解,开发出来的。

siRNA的输送对于基因沉默实验是至关重要的。合成的siRNA分子可以通过电穿孔或者亲脂的试剂,输送到细胞内。但是,这两种方法都是暂时的。质粒系统能够用于表达短发卡RNA(shRNA)分子,它们是Dicer酶的底物,在体内能成熟成为siRNA分子。这样的系统能稳定地抑制目标基因的表达。也有一些病毒输送系统,能够将shRNA输送到难于转染的细胞系中。

RNA操作常见注意事项

核糖核酸酶(RNase)是非常稳定、活跃的酶,它们通常不需要辅因子就能发挥功能。由于核糖核酸酶难以失活,并且很小的量就足以破坏RNA分子,因此在没有事先消除任何可能的核糖核酸酶污染的情况下,不要使用任何塑料或者玻璃器皿。处理RNA时应非常小心,以避免在纯化的过程中或者纯化之后,将核糖核酸酶无意的引入到RNA样品中。为了创造并维持没有核糖核酸酶的环境,在预处理以及使用一次性和非一次性的器皿和溶液处理RNA时,一定要采取以下预防措施。

常规操作

处理RNA时,一定要使用合适的微生物学的无菌技术。手和灰尘颗粒可能会携带细菌和霉菌,是最常见的核糖核酸酶污染源。为了阻止来源于皮肤表面或者实验室器械灰尘上的核糖核酸酶污染,在操纵试剂以及RNA样品的时候,一直要佩戴乳胶手套或者乙烯基手套(PVC手套)。可能的情况下,要经常更换手套,并将试管处于关闭状态。当用移液管吸取溶液用于下游应用时,要将纯化过的RNA放在冰上。

为了去除工作台表面、非一次性塑料器皿和实验室器械(比如,移液管和电泳槽)上的核糖核酸酶污染,推荐使用市售核糖核酸酶去除溶液。也可以使用常见的实验室试剂去除核糖核酸酶的污染。为了去除塑料器皿上的污染,使用0.1 M NaOH, 1 mM EDTA洗涤,然后使用去RNase的水洗涤;如果塑料器皿具有耐氯仿性,则可用氯仿洗涤。为了去除电泳槽的污染,可使用去污剂清洁(比如,0.5%的SDS),使用去RNase的水洗涤,然后用乙醇洗涤(如果电泳槽具有耐乙醇性),之后晾干。

重要:在使用化学试剂时,一定要穿戴合适的实验工作服,一次性的手套,以及具有护目镜。请参考产品厂商提供的相应安全数据说明书(SDS),了解更多信息。

一次性塑料耗材

在处理RNA的时候,推荐使用无菌的,一次性的聚丙烯管。这些试管通常没有核糖核酸酶,因此不需要预处理使核糖核酸酶失活。

非一次性的塑料耗材

非一次性的塑料耗材在使用之前应该进行处理,以确保其不含有核糖核酸酶。塑料耗材应该严格的使用0.1 M NaOH、1 mM EDTA洗涤,然后用去RNase的水洗涤。具有耐氯仿性的塑料耗材可以使用氯仿洗涤,以使核糖核酸酶失活。

玻璃器皿

玻璃器皿在使用之前,应该进行处理,以确保其不含有核糖核酸酶。用于处理RNA的玻璃器皿在使用之前,应该使用去污剂清洁,严格的洗涤,并在240°C的烘箱中烘烤至少4小时(如果更方便的话,可以过夜)。也可以使用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理玻璃器皿。使用0.1%的DEPC(0.1%的水溶液)充满玻璃器皿,在37°C的条件下过夜(12小时),然后使用高压釜处理或者加热到100°C 15分钟,以去除剩余的DEPC。

重要:在使用化学试剂时,一定要穿戴合适的实验工作服,一次性的手套以及护目镜。请参考产品厂商提供的安全数据说明书(SDS),了解更多信息。

电泳槽

电泳槽应使用去污剂(比如,0.5%的SDS)清洁,严格的用去RNase的水洗涤,然后使用乙醇洗涤,之后晾干。

重要:在使用化学试剂时,一定要穿戴合适的实验工作服,一次性的手套以及护目镜。请参考产品厂商处提供的相应安全数据说明书(SDS),了解更多信息。

重要:一些电泳槽使用的塑料不具有耐乙醇性,需要仔细查阅厂商说明书。

溶液

溶液(水或者其它溶液)应该使用0.1%的DEPC处理。DEPC是一种强大但非绝对的RNase抑制剂,它通过共价修饰RNase发挥作用。

重要:在使用化学试剂时,一定要穿戴合适的实验工作服,一次性的手套以及护目镜。请参考产品厂商提供的相应安全数据说明书(SDS),了解更多信息。

不含RNase的溶液的制备

溶液(水或者其它溶液)应该使用0.1%的DEPC处理。DEPC是一种强大但非绝对的RNase抑制剂。浓度为0.1%的DEPC经常用于处理玻璃或者塑料耗材,以使其表面的RNase失活,或者制备不含RNase的的溶液和水。DEPC通过共价修饰使RNase失活。在100 ml要处理的溶液中加入0.1 ml DEPC,大力的摇晃,以使DEPC充分进入溶液。将溶液在37°C的条件下孵育12个小时。在高压灭菌器内处理15 min以去除任何DEPC的痕迹。DEPC与伯胺发生反应,因此不能直接用于处理Tris缓冲液。在Tris缓冲液存在的条件下,DEPC非常不稳定,迅速分解为乙醇和CO2。在制备Tris缓冲液时,应先使用DEPC处理水,然后将Tris溶解以制备合适的缓冲液。痕量的DEPC会通过乙酰基化作用,与RNA分子中的嘌呤残基反应,将其修饰。在细胞外的环境中,乙酰基化的RNA分子以很低的效率被翻译。但是,除非有大量的嘌呤残基被修饰了,否则不会严重的影响这些RNA分子杂交形成DNA:RNA或者RNA:RNA杂交物的能力。溶液或者器皿上残留的DEPC,一定要在高压灭菌器中处理或者加热到100°C处理15 min,以便除去。

重要:在使用化学试剂时,一定要穿戴合适的实验工作服,一次性的手套以及护目镜。请参考产品厂商提供的相应安全数据说明书(SDS),了解更多信息。

生物样本中RNA的稳定处理

为了确保基因表达分析的精确性,所分析的RNA应能够准确地反映出其在生物样本中的体内表达情况。但实际在样本的操作和RNA的分离过程中,RNA很容易发生改变而使情况变得复杂。

生物样本一经提取,其中的RNA即变得极不稳定。期间所发生的人为影响主要分成两种。基因的下调和RNA的酶促降解会导致mRNA特异性或非特异地发生人为降低。同时在操作和加工样本的过程中,某些基因会被诱导表达。这两种效应的综合可能在检出的转录谱与体内真实情况之间造成偏差。

对RNA表达谱进行即刻的稳定化处理是精确基因表达分析中的首要事项。通常情况下,用于RNA分析的样本被迅速置于液氮中冷冻,在进一步处理之前一直储存于–80°C下。产品供应商也提供了一些稳定处理试剂,作为替代方法对生物样本中的RNA进行稳定化处理。这些供应商提供了集成化的样本处理溶液(套装),其中包括容器,稳定处理试剂及制备试剂盒。

RNA的大小和分子量

不同RNA的大小和分子量
RNA 核苷酸 分子量(道尔顿)
E. coli
tRNA
5S rRNA
16S rRNA
23S rRNA

75
120
1541
2904

2.6 x 104
4.1 x 104
5.2 x 105
9.9 x 105
果蝇 
18S rRNA
28S rRNA

1976
3898

6.7 x 105
1.3 x 106
小鼠
18S rRNA
28S rRNA

1869
4712

6.4 x 105
1.6 x 106
兔子
18S rRNA
28S rRNA

2366
6333

8.0 x 105
2.2 x 106

18S rRNA
28S rRNA

1868
5025

6.4 x 105
1.7 x 106
来自参考文献2。
换算为核酸:RNA

RNA分子量和摩尔换算

  • 单链RNA分子的MW(钠盐)= (碱基数量) x (343道尔顿/碱基)

 

RNA摩尔换算*
RNA微克量 皮摩尔 分子
1.0 1.67 1.0 x 1012
0.6 1.0 1.0 x 1011
* mRNA平均长度为1930个核苷酸。

RNA分离:起始材料的破碎和匀浆

起始材料的有效破碎和匀浆对于所有总DNA分离操作来说都是必须的要求。破碎和匀浆是两个独立分开的步骤。

  • 破碎:对于组织结构、细胞壁和细胞质膜的彻底破碎对于释放样本中所有的RNA是绝对必要的。不同样本需要使用不同的方法以达到彻底的破碎效果。不完全的破碎会导致RNA得率的显著降低。
  • 匀浆:匀浆对于减少破碎后细胞裂解产物的粘性是十分必要的。匀浆能够切断高分子量的基因组DNA及其他高分子量的细胞组分,得到均匀的裂解产物。匀浆不够彻底会导致RNA结合效率的下降而显著降低得率。

某些破碎方法能够同时对样本起到匀浆作用,而其他方法还是需要专门的匀浆步骤。表针对不同样本进行破碎和匀浆的准则全面概述了适用于多种起始材料的不同破碎和匀浆方法。当您针对所使用的起始材料选择合适的操作方法时,该表格可用来作为参考。下面也将针对破碎和匀浆方法进行更为详细的论述。

使用玻珠研磨机进行破碎和匀浆

在使用玻珠研磨机破碎样本的过程中,样本与珠子被一起进行高速搅拌。通过珠子与细胞碰撞时的流体动力切割和破碎作用,同步完成破碎和匀浆过程。破碎效率的影响因素有:

  • 珠子的大小和组成
  • 缓冲液与珠子的比例
  • 起始样本的数量
  • 搅拌速度和设定
  • 处理时间

细菌破碎时所使用的理想珠型为0.1毫米(平均直径)的玻璃珠,用于酵母和单细胞动物细胞时为0.5毫米的玻璃珠,对动植物组织则应使用3–7毫米的不锈钢珠。请确保玻璃珠经过浓硝酸的预先润洗。或者可直接购买和使用市售的经酸洗涤过的玻璃珠。关于破碎的其他参数需要依据每一应用的经验进行设定。植物材料以及相关的珠子和破碎管可先在液氮中预冷,破碎应在无裂解缓冲液的条件下进行。对于动物组织则应使用干燥的冷冻粉碎。冷冻粉碎(无论是在玻珠研磨机中还是使用研钵和杵)不同于缓冲液裂解,不会对样本同时起到匀浆作用。

使用转子——定子匀浆器进行破碎和匀浆

在裂解缓冲液的存在下,转子–定子匀浆机可同时完成对动物组织的彻底破碎和匀浆,所需时间基于样本的坚韧程度,可在5–90秒内完成。转子–定子匀浆机也可以用于细胞裂解产物的匀浆。转子的超高速旋转能够以扰动和机械剪切的综合方式,完成对样本的破碎和匀浆。使用适当大小的管子,在匀浆过程中始终保证匀浆器头部一直处于浸没状态,并持续将匀浆器头部伸入管子末端,以确保匀浆过程中样本内的泡沫达到最少。转子–定子匀浆机有不同大小型号可供选择,并可装配不同大小的探头。5 mm和7 mm的探头适合在300 µl以下的体积内使用,并可用于离心管内的匀浆。10 mm及以上尺寸的探头则适用于更大的管子。

使用研钵和杵破碎

使用研钵和杵破碎时,先将样本进行迅速的液氮冷冻,并在液氮中将其研磨为细粉。将上清液(组织粉末和液氮)转移至液氮预冷的适当大小的管中,使液氮挥发但不要让样品融解。加入裂解缓冲液,并尽可能快地进行后续步骤。

注:使用研钵和杵研磨样品会破碎样品,但无法达到匀浆的目的。匀浆作用需与此步骤分开进行。

使用注射器和针头完成匀浆

细胞和组织的裂解产物可以使用注射器和针头进行匀浆。可以使用20号(0.9 mm)针头连接一个灭菌塑料注射器,通过至少5–10次的吹打切断高分子量的DNA,直至裂解产物的匀浆形成。为操作便利和减少样品损失,也可能需要增加裂解缓冲液的体积。

针对不同样本进行破碎和匀浆的准则
起始材料 破碎方法 匀浆方法 评论
培养的动物细胞 加入裂解缓冲液 使用转子–定子匀浆机或注射器和针头获取胞质RNA 如果处理少于1x105个细胞,可以使用涡动匀浆裂解产物。不提供匀浆方案。
动物组织 转子–定子匀浆机 转子–定子匀浆机 同步进行破碎和匀浆
动物组织 研钵和杵 注射器和针头 使用转子–定子匀浆机和玻珠研磨机通常比使用研钵和杵的得率更高。
动物组织 玻珠研磨机 玻珠研磨机
细菌 加入裂解缓冲液进行酶(溶菌酶)解 涡旋机 如果处理大于5x108个细胞,使用注射器和针头进行匀浆可能会增加得率。
细菌 玻珠研磨机 玻珠研磨机 玻珠研磨机可同时完成破碎和匀浆;不能使用涡动操作代替玻珠研磨机。
酵母 酶解(溶菌酶/消解酶)细胞壁后加入裂解缓冲液,以消化原生质球。 涡旋机
酵母 玻珠研磨机 玻珠研磨机 玻珠研磨机可同时完成破碎和匀浆;不能使用涡动操作代替玻珠研磨机。
植物和丝状真菌 研钵和杵 注射器和针头 研钵和杵不能代替转子–定子匀浆机。

从不同样本来源分离RNA的特别注意事项

一些样本来源在其RNA或内含物方面存在着显著不同,可能导致RNA的分离和分析过程出现问题。当操作这些样本来源时需要一些特别注意事项。本节将针对大量不同样本来源的操作进行探讨。

植物

从植物材料中分离RNA会遇到一些特殊困难,常规技术在用于植物样本之前一般要先经过条件优化。一些植物代谢产物的化学性质与核酸相似,导致其难于从RNA制备产物中除去。(使用不当的)纯化方法(如盐类或苯酚)所导致的代谢物(例如多糖类、多酚类和黄酮类)或污染物与目的RNA的共分离,可能造成对酶促反应的抑制,或导致紫外分光光度测定和凝胶电泳结果上的偏差。从植物材料中分离RNA的过程中可能遇到的困难还包括由于较高粘性导致的吸取体积错误,以及储存过程中的RNA降解问题。

通常对植物的生长条件进行优化,使其不产生高水平的植物代谢产物,可有助于对RNA的有效分离。由于植物种类之间存在较大差异,因此对其生长条件很难有同一的指导标准。不过作为普适原则,建议尽可能使用健康幼嫩的植物组织。年轻植物组织的RNA得率通常高于年老组织,因为前者在等重条件下通常比后者包含更多的细胞。而且等重的年轻组织通常也包含更少的代谢物。此外,许多“自定义”的RNA分离方法都推荐将植物组织在黑暗中培养1–2天后再进行收获,以避免形成植物代谢物的高水平积累。

心脏、肌肉和皮肤组织

从例如骨骼肌、心脏和皮肤组织一类的样本中分离RNA可能比较困难,因为此类样品中含有大量的收缩性蛋白、结缔组织和胶原。为了去除这些可能对RNA分离造成干扰的蛋白,需要使用蛋白酶或含苯酚的裂解试剂对此类样本进行处理。不过,蛋白酶的消化过程需要避免RNA发生降解。

细菌

细菌mRNA的很多基本特征都不同于真核生物的mRNA。原核生物的mRNA没有5'帽子,也很少具有poly A尾。缺少poly A尾的mRNA无法通过杂交进行捕获。另外,也无法在合成初始链的过程中使用寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷(oligo–dT)引物,只能使用随机引物作为替代。

此外,细菌RNA也十分地不稳定,快速生长的品种中RNA的平均半衰期约为3分钟。某些细菌的mRNA在翻译同时即发生降解。因此对于尝试从细菌中分离mRNA的研究人员来说,这可算是一个大麻烦。也由于细菌中的mRNA的周转(从生成到降解)非常快,造成原核生物的基因表达研究比真核生物更为困难。为了精确地保留基因表达谱,并使完好mRNA的得率最大化,在样本获取和加工之前需要对其进行稳定处理。

血液

血液直接源于临床分析的收集样本。在收集管中使用RNA稳定处理试剂可成功保存血液样本的RNA。从血液中分离RNA的方法,需要能够确保生成无污染物或酶抑制剂的高质量RNA。血液中所含有的大量酶抑制剂会对下游的RNA分析造成干扰。此外,如肝素和EDTA等一类常规的抗凝血剂也会干扰下游分析。应注意抗凝血剂并不会对RNA起到稳定化作用。

人类血液中的红血球(血红细胞)不含细胞核,因此不会合成RNA;通常情况下这类细胞仅含有非常微量的RNA,而不是RNA分离的主要对象。从全血中分离RNA的主要靶标细胞为白血球(白细胞),这类细胞含有细胞核和RNA。白血球由三种主要的细胞类型构成:淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。

由于健康的血液中所含的红细胞数量约为白细胞的1000倍,去除红细胞会有助于简化RNA分离步骤。可通过选择性地裂解红细胞来达到此目的,因为红细胞对低渗休克更为敏感(相比白血球),在低渗缓冲液中会迅速发生破裂。

裂解红细胞的另一种常见替代方法是Ficoll密度——梯度离心法。与红血球裂解法不同,Ficoll密度——梯度离心法仅获取单核的细胞(淋巴细胞和单核细胞),而会去除粒细胞。经Ficoll密度––梯度离心法分离出的单核细胞能够使用与其他动物细胞一样的方法进行RNA分离。

FFPE组织样品

福尔马林固定,石蜡包埋(FFPE)的组织样本是生物医学研究中的重要和广泛的样本来源。越来越多的研究者开始针对FFPE样本开始分子水平的分析,因此考虑这些样本的独特属性以发展针对性的分离方法变得越来越重要。

由于在固定和包埋过程中使用了甲醛,通常会使FFPE样本中的核酸发生严重的片段化和化学改变。因此,从FFPE样本中分离到的核酸会比新鲜样本或冰冻样本的分子量更低。其片段化程度基于样本类型、保存期长短,以及固定、包埋和储存的条件而发生变化。尽管在凝胶电泳或芯片实验室(lab–on–a–chip)分析等标准质量控制分析中无法测得甲醛修饰情况,但后者实际会对酶学分析造成严重干扰。

为了将FFPE储存法对RNA转录物的影响降至最低,应牢记下列小贴士:

  • 尽可能快地取样和固定组织
  • 不要使用厚度超过5 mm的样本,样本固定时间不宜过长(最长24小时)
  • 使用优质的试剂进行石蜡包埋,不要加入其它添加剂
  • 尽可能避免对样本进行染色
  • 适当地储存FFPE样本(RNA在4°C可完好保存至1年,优于保存在室温或更高温度)
  • 使用适当的脱石蜡步骤
  • RNA分离应包含一个解交联的步骤
RNA病毒

一些病毒含有单链或双链的RNA基因组。RNA病毒通常从无细胞的体液中得到分离,在这类样本中它们的滴度非常之低。在进行RNA的分离之前,病毒颗粒可能需要超速离心、超滤作用或沉淀步骤进行浓缩。在RNA的分离过程中如果预期得率很低,则可能需要加入载体RNA。

病毒RNA的主要问题在于其通常具有复杂的二级结构。这使下游分析变得异常困难。许多逆转录酶的转录过程难于通过复杂的RNA二级结构。另外,RNA病毒还具有较高的突变率,因为它们的复制过程并不精确。这样就很难获得均一的成分用于后续分析。

血浆或血清(或其他体液样本)中的游离RNA

在血浆、血清、尿液、其他体液以及细胞培养上清中都存在着与蛋白脂质(囊泡)或蛋白质相结合的RNA,特别是miRNA。 这些RNA的浓度大大低于细胞内的RNA,但比人类血浆中的游离DNA浓度要高大约10倍。在人体血液中RNA相对稳定,半衰期为2天左右。尽管如此,RNA在反复冻融的条件下依然会降解。当分离体液中的游离病毒RNA时,可能有必要加入载体RNA。

特定RNA病毒
病毒 基因组
Adenoviridae Adenovirus dsDNA
Arenaviridae Lassa virus ssRNA
Bornaviridae Borna disease virus ssRNA
Bunyaviridae Hantaan virus ssRNA
Caliciviridae Hepatitis E virus, Norwalk virus ssRNA
Filoviridae Ebola virus ssRNA
Flaviviridae Hepatitis C and G viruses, Dengue virus ssRNA
Hepadnaviridae Hepatitis B virus ss/dsDNA
Herpesviridae Herpesviruses (HSV; CMV; EBV; HHV6, 7, 8) dsDNA
Papovaviridae Human papillomavirus, JC virus ssDNA
Paramyxoviridae Parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, rubulavirus ssRNA
Parvoviridae Parvovirus B19 (erythrovirus) ssDNA
Picornaviridae Coxsackie virus, foot-and-mouth disease virus, hepatitis A virus, poliovirus, rhinovirus ssRNA
Reoviridae Rotavirus dsRNA
Retroviridae Human foamy virus, human immunodeficiency virus, human T-cell leukemia virus ssRNA
Rhabdoviridae Rabies virus ssRNA

RNA的储存

纯RNA可以储存在–20°C或–70°C的不含RNase的水中。在上述条件下,1年内都不会发生RNA降解。

RNA定量

参见“使用分光光度法测定RNA浓度”。正如“确定RNA的品质”中所述,260 nm与280 nm波长的吸光度之间的比值能够指示RNA的纯度。

微量(或微滴)紫外读取器(例如Nanodrop)也经常用来确定RNA浓度。

在检测RNA样本时,需确保比色杯中去除了RNA酶,特别是在使用分光光度测定之后仍需回收这些RNA的情况下。该条件可通过使用0.1 M NaOH,1mM EDTA和不含RNase的水的顺序洗涤来实现。使用稀释RNA的缓冲液为分光光度计设定空白对照。

使用分光光度法测定RNA浓度

在使用紫外通透的塑料比色杯的分光光度计中,测量260 nm的吸光值(A260)以确定RNA的浓度。为了确保获得有意义的结果,读值应在0.15与1.0之间。在260 nm波长下,1个单位的吸光值对应每毫升44 µg的RNA浓度(A260=1 → 44 µg/ml;基于标准的1 cm测光距离)。这一相关性仅对中性pH值条件下的检测有效。因此,如需稀释RNA样品,则应使用中性pH值的低盐缓冲液(例如10 mM Tris•Cl ,pH7.0)。

在检测RNA样本时,需确保比色杯中去除了RNA酶,特别是在使用分光光度测定之后仍需回收这些RNA的情况下。这可以通过使用0.1 M NaOH,1mM EDTA和不含RNase的水的顺序洗涤来实现。使用稀释RNA的缓冲液为分光光度计设定空白对照。列举一个RNA定量中的计算实例如下:

RNA定量举例
RNA样品的体积= 100 µl
稀释=10 µl RNA样品+490µl 10 mM Tris•Cl ,pH 7.0(1/50的稀释比)
使用1 ml(已去除RNA酶)比色杯,检测稀释后样本的吸光度
A260 = 0.2

RNA浓度
= 44 µg/ml x A260 x稀释系数
= 44 µg/ml x 0.2 x 50
= 440 µg/ml

RNA总量
=浓度x以毫升为单位的样品体积
= 440 µg/ml x 0.1 ml
= 44 µg RNA

确定RNA的品质

RNA纯度

在260 nm与280 nm读值之间的比例(A260/A280)能够反映RNA的纯度,因为如蛋白一类的污染物会吸收紫外光。不过,A260/A280的比值也受到pH值的显著影响。当使用没有缓冲能力的水时,pH值与A260/A280的比值结果都会发生大范围的改变。 较低的pH值会导致A260/A280的比值变小,对蛋白质污染的敏感性也会随之降低(3)。

为了获得精确的比率,我们建议在微碱的低盐缓冲液中检测吸光度(例如10 mM Tris•Cl,pH7.5)。在10 mM Tris•Cl,pH 7.5缓冲液当中,纯RNA的A260/A280 比率约为1.9–2.1。

注:某些分光光度计在检测纯RNA时,可常规获得高达2.3的比值。

请确保使用同种溶液校准分光光度计。不过,为了准确确定RNA的浓度,我们仍建议使用中性缓冲液稀释RNA样本,因为吸光度和浓度(A260读值为1相当于44 µg/ml的RNA浓度)之间的关系是一个基于中性条件获得的吸光系数。

RNA的完整度

总RNA的完整度和大小分布可以通过变性的琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色或市售的检测系统(如QIAxcel系统或Agilent 2100 )进行检测。每条核糖体RNA的富集区域在凝胶染色之后应显现为锐利的条带。28S核糖体RNA的条带亮度应为18S rRNA条带的两倍左右。如果某一泳道中核糖体RNA条带不够锐利,却出现小尺寸RNA的弥散情况,则很可能因为RNA样品在制备过程中发生了严重的降解。

Agilent 2100 Bioanalyzer也能够提供RNA完整数目(RNA Integrity Number,RIN)这一参数,作为对RNA完整度的一个有用量度。在理想情况下RIN值应接近10,不过在许多情况下(特别是对组织样本来说),RNA品质主要取决于原始样本的保存情况。

不同来源的核糖体RNA大小
来源 rRNA 大小(kb)
E. coli 16S
23S
1.5
2.9
S. cerevisiae 18S
26S
2.0
3.8
小鼠 18S
28S
1.9
4.7
18S
28S
1.9
5.0

RNA分析:分析凝胶

变性凝胶分析的原理

利用RNA在甲醛琼脂糖凝胶中的电荷迁移效应,可对RNA进行分离和鉴定。RNA不像DNA,它们具有复杂的二级结构,因此需使用变性凝胶。凝胶中的甲醛能够破坏RNA的二级结构,从而使得RNA分子严格按照电荷迁移的方式得到有效分离。

在电场中,主链磷酸基团上所携带的负电荷使核酸分子向阳极移动。变性的RNA分子的迁移速率取决于它们的尺寸大小;不过片段大小与迁移速率之间并非线性相关,因为更大的片段会遇到更大的摩擦阻力,在凝胶中移动更为困难。

琼脂糖凝胶分析是最为常用的RNA分析方法,通常依据RNA的大小相应选择合适分辨范围的琼脂糖凝胶。小的RNA片段,如tRNA或5S rRNA,可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。可查阅分子生物学手册(2,4)以获得关于各类分析胶的详细信息。本节将针对甲醛琼脂糖凝胶电泳进行介绍。

制备用于RNA分析的甲醛琼脂糖凝胶

下列甲醛琼脂糖(FA)凝胶电泳方案能够提高凝胶分离及后续检测(例如RNA印迹)的灵敏度。本方案的关键特点在于使用了浓缩的RNA上样缓冲液,从而(相比传统实验方案)能够向凝胶中载入更大量的RNA样本。

琼脂糖

用于制备凝胶的琼脂糖是针对所分离RNA片段的大小来确定浓度范围的。对于大多数的目的RNA种类来说,使用1.0–1.2%(质量体积比)的琼脂糖浓度可获得最佳结果。对于较大的mRNA种类,降低琼脂糖浓度可能会有所帮助。如需分离更小的mRNA,琼脂糖浓度可提高至2%。对于较小的RNA种类,如tRNA或rRNA,则推荐使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。

请使用超纯琼脂糖,因为如多糖类、盐类和蛋白一类的杂质都会对RNA的迁移造成影响。

小贴士:某些电泳槽的塑料不耐乙醇。请对此适当留意,并核对厂商的说明书。

制胶
  1. 制备足够的10x FA凝胶缓冲液用于制胶,配制足够的FA凝胶电泳缓冲液以装满整个电泳槽。
  2. 将适量的琼脂糖、10xFA凝胶缓冲液,以及不含RNase的的水在培养瓶或烧瓶中混合。
    制备尺寸为10x14x0.7 cm的FA凝胶,请混合以下试剂:
    1.0–1.2 g 琼脂糖
    10 ml 10x FA凝胶缓冲液
    加入不含RNase的的水至100 ml
    混合物的体积不要超过容器的一半。将容器封口以避免蒸发。
    小贴士:如需配制更小或更大的凝胶,请按比例调整组分的用量。
  3. 在微波炉或沸水浴中加热混合物,偶尔摇动混合物容器直至琼脂糖完全溶解。
    小贴士:请确保烧瓶盖为松弛状态以避免压力过高。请小心避免琼脂糖溶液过热导致沸腾溢出。
    小贴士:如果在加热过程中液体体积由于蒸发作用而明显变少,可使用不含RNase的的蒸馏水补充至原体积。这将保证琼脂糖浓度的准确性。
  4. 将琼脂糖溶液在水浴中降温至65–70°C。偶尔摇动或涡动溶液,以避免发生不均匀冷却的现象。
  5. 冷却后,加入1.8 ml 37%(12.3 M)的甲醛和1 µl 10 mg/ml的溴化乙锭母液。
    小贴士:甲醛有毒。请在通风橱中操作以避免吸入。操作时请佩戴手套并使用适当的安全预防措施。
    小贴士:在加入甲醛和溴化乙锭之前,请确保溶液已充分冷却。如果溶液仍过热,甲醛会变质甚至失效。
    小贴士:凝胶中的溴化乙锭使RNA在紫外光下变得可见。溴化乙锭有毒并具有强力诱变作用。操作时请佩戴手套并使用适当的安全预防措施。建议使用丁腈手套,因为乳胶手套无法提供完全的防护。使用后应按照常用手册中的说明,对溴化乙锭溶液进行净化处理。
    小贴士:溴化乙锭母液(一般为10 mg/ml的水溶液)应置于深色瓶或包有铝箔的瓶中,并储存于2–8°C的条件下。
  6. 在通风橱内将琼脂糖溶液倒入3–5 mm厚的凝胶盘中。在倒胶之前或之后迅速插入梳子。放置凝胶使其冷却至少30分钟。
    小贴士:请确保梳子底部和凝胶盘之间留有足够的间距(0.5–1.0 mm),以形成完整的样品孔和避免样品渗漏。
    小贴士:请确保凝胶或样品孔之间无任何气泡。在凝胶冷却凝固之前可以使用巴斯德吸管将气泡小心除去。
    小贴士:可以配制更厚的凝胶,方便更大样本量的载入。更薄的凝胶在RNA印迹当中的转印效果更优,不过载入的样本量也更小。
    小贴士:梳子的厚度会影响凝胶中条带的锐度。更薄的梳子形成的条带更为锐利,不过每个样品孔中能够载入的样品量也更少。
  7. 将凝胶放置于电泳槽内,期间不要拔出梳子。向电泳槽内添入1xFA凝胶电泳缓冲液。
    小贴士:加入足够的缓冲液以确保凝胶上覆盖有1 mm深度的缓冲液。如果加入了过多的缓冲液,则电流将直接通过缓冲液而很少通过凝胶。
  8. 从凝胶中小心拔去梳子。在运行电泳前,让凝胶在1xFA凝胶电泳缓冲液中平衡至少30分钟。

 

FA凝胶缓冲液*
1x工作溶液的成分 成分 每升的量
20 mM MOPS MOPS fre acid 41.9 g
5 mM醋酸钠 醋酸钠·H2O 6.8 g
1 mM EDTA 0.5 M EDTA, pH 8.0 20 ml
Adjust to pH 7.0 using NaOH.
* FA凝胶缓冲液在高压灭菌过程中变黄,这不影响凝胶电泳。
也可使用4.1g无水乙酸钠

 

FA跑胶缓冲液
5x工作溶液的成分 成分 每升的量
1x FA凝胶缓冲液 10x FA凝胶缓冲液 100 ml
2.5 M甲醛* 37% (12.3 M) 甲醛 20 ml
不含RNase的水 880 ml
*有毒并且/或致突变。应采取适当的安全措施。
参见制备不含RNase的溶液。

对RNA的甲醛变性凝胶电泳及分析

RNA上样缓冲液

向凝胶上样之前,须向样品中加入RNA上样缓冲液。上样缓冲液的作用主要有三个:

  • 上样之前对RNA样本进行变性。
  • 增加样本的密度,确保其在上样过程中沉入样品孔底部。
  • 使用染料为样品上色,帮助上样并对电泳过程起到显像和指导作用。

浓缩的RNA上样缓冲液的关键特点在于,(与传统方法相比)它能够有助于向凝胶中载入更大数量的RNA样本。

RNA上样缓冲液
5x工作溶液的成分 成分 每10 ml的量
0.25%溴酚蓝 溴酚蓝 25 mg*
4 mM EDTA 0.5 M EDTA, pH 8.0 80 µl
0.9 M 甲醛 37% (12.3 M) 甲醛 750 µl
20%甘油 甘油 2 ml
30.1%甲酰胺 甲酰胺 3.084 ml
4x FA凝胶缓冲液 10x FA凝胶缓冲液 4 ml
在2–8°C条件下可保持稳定达3个月。
*作为替代方法,可使用16 µl饱和的溴酚蓝水溶液替代25 mg粉末。配制该溶液的方法是使用蒸馏水溶解和混匀固体溴酚蓝,持续加入溴酚蓝直至饱和。再通过离心沉淀未溶解的粉末,小心吸出上清液。
有毒并且/或致突变。应采取适当的安全措施。
电泳缓冲液

RNA凝胶的电泳条件比DNA凝胶的pH值更低,因为RNA的pKa值低于DNA。此外,RNA不同于DNA,其在高pH条件下容易发生碱性裂解。因此RNA凝胶应于中性pH条件下进行电泳。MOPS(3-(N-吗啡啉)丙磺酸)是RNA凝胶最为常用的缓冲体系,因为它在pH 7.0具有很强的缓冲能力。电泳缓冲液中所含的甲醛能够保持RNA处于变性状态。琼脂糖凝胶中也需含有甲醛。

注:电泳槽应使用洗涤液(例如0.5%的SDS)进行清洗,之后使用不含RNase的的水彻底漂洗,并换用乙醇漂洗和干燥。不过某些电泳槽的塑料不耐乙醇。请对此适当留意,并查阅厂商说明书。

电泳的样本制备
  1. 向4倍体积的RNA样品中加入1倍体积的5x RNA上样缓冲液(例如5 µl上样缓冲液和20 µl RNA),并混匀。
    向凝胶中上样之前一定在样品中混合RNA上样缓冲液。
    小贴士:加入的样品体积最好不要接近样品孔的承载能力,否则样品可能会溢出到邻近的样品孔中。
    小贴士:请确定所有的样品都具有相同的缓冲液成份。高盐会延迟RNA分子的迁移。
    小贴士:请确保使用不含乙醇的样品,例如,使用经纯化的RNA样品。
    小贴士:乙醇可能导致样品漂出上样孔。
  2. 在65°C孵育3–5分钟以变性RNA。再置于冰上冷却。
电泳
  1. 向凝胶的上样孔中载入变性样品。上样之前凝胶应浸没在电泳槽内的电泳缓冲液中。
    小贴士:上样之前,通过电泳缓冲液的冲洗来清除上样孔中的气泡。
    小贴士:请确保整块胶都浸没于FA凝胶电泳缓冲液当中。
    小贴士:在上样过程中,将枪头尖插入样品孔底部进行上样,缓慢排除孔中的液体。留意不要让枪头尖损伤到凝胶。
    小贴士:样品一旦上样完成就不要再移动凝胶盘/电泳槽,以防止样品从孔中溢出。
    小贴士:请确保至少在一个泳道中上样了适当的分子量标记物。
  2. 连上电泳仪的电极,使RNA向阳极或正极导线(通常为红色)移动。
    小贴士:电泳仪应一直盖严以防止发生触电。
    小贴士:在通风橱内进行凝胶电泳,以避免使实验人员暴露于凝胶和缓冲液挥发出的甲醛中。
  3. 开启电源,在5–7 V/cm的电场强度下进行电泳,直至溴酚蓝染料电泳至凝胶约2/3处。
    小贴士:避免使用过高的电压,后者可能导致RNA条带的拖尾和弥散现象的发生。
    小贴士:在电泳过程中定期对缓冲液的温度进行监控。高温可能导致凝胶部分融化和条带变形。如果缓冲液变得很热,则需降低电压。
    小贴士:如果电泳时间很长(如过夜电泳),可使用一个液体泵来循环利用缓冲液。
凝胶成像分析

凝胶中的溴化乙锭能够使RNA在紫外光下显影。使用过后的溴化乙锭溶液应依照常用手册中的说明(2,4)进行净化。

溴化乙锭母液(一般为10 mg/ml的水溶液)应置于深色瓶或包有铝箔的瓶中,并储存于2–8°C的条件下。

成像

在溶液中溴化乙锭——RNA复合物能够发出比未结合的染料发出更强的荧光。这意味着在紫外光(254–366 nm)的照射下,已着色胶上的RNA条带将会在未结合染料的本底中显现出来。凝胶图像可以通过利用宝丽来照片或凝胶记录系统进行存档。

小贴士:紫外线会损伤眼睛和皮肤。当在紫外光下工作时,请保持使用适当的眼睛和面部防护措施。

小贴士:紫外线会损伤RNA。如果后续需要从凝胶中提取RNA,则应尽可能使用低强度的紫外线光源,并使RNA暴露于紫外线的时间达到最短。

分析总RNA

总RNA的完整度和大小分布可以通过观察着色RNA得到分析。在着色胶中每一种核糖体RNA都应显示为一条锐利的条带。如果某一泳道中核糖体RNA条带不够锐利,却出现小尺寸RNA的弥散情况,则很可能因为RNA样品在制备过程中发生了严重的降解。28S核糖体RNA的信号强度应约为18S核糖体RNA条带的两倍左右。由于28S rRNA相比18S rRNA更加不稳定,如果两者的条带强度相当,则表明RNA样品发生了一定程度的降解。

RNA分析:Northern印迹

在变性凝胶中基于电荷迁移法分离RNA分子之后,可通过毛细管转印法将凝胶中的RNA分子转印至尼龙膜或硝酸纤维素膜上。可使用放射性或化学发光探针杂交检测目的RNA,并通过放射性自显影或拍照进行成像。

由于DNA印迹法以其发明人E. M. Southern的名字命名为“Southern印迹”,与其相似的RNA印迹法即被称之为“Northern印迹”。

Northern印迹的实验流程

以下为RNA印迹法的一个具体实验方案。该流程针对标准的甲醛琼脂糖凝胶进行设计,制备和电泳过程参见“RNA分析:分析胶”。

印迹膜

RNA印迹法中通常将RNA固着于尼龙膜或硝酸纤维素膜上。一般推荐使用正电性的尼龙膜,因为它们的强度和操作性都优于硝酸纤维素膜。

小贴士:在操作印迹膜时请一直佩戴手套。从膜的边缘,或使用钝头镊子小心操作印迹膜。

转印缓冲液

甲醛琼脂糖RNA凝胶通常在如20xSSC一类的高盐缓冲条件下进行转印。请制备1.2公升的20xSSC溶液。如需配置更大的RNA凝胶(大于100 ml体积),则需制备2.4公升20xSSC溶液。

小贴士:吸取200 ml体积的20xSSC溶液,稀释两倍以获得10xSSC溶液,用于转印后RNA印迹膜的浸泡和洗涤。

Northern转印缓冲液
20x SSC工作溶液的成分 成分 每升的量
3 M NaCl NaCl 175.3 g
0.3 M柠檬酸钠 柠檬酸钠·2H2O 88.2 g
使用NaOH调整至pH 7.0。

所需仪器

  • Whatman 3MM滤纸
  • 15–20 cm左右厚度的一摞纸巾
  • 塑料薄膜
  • 两块玻璃板或有机玻璃板
  • 能够装载1–2公升缓冲液的托盘(例如玻璃焙盘)
  • 1公斤左右的平板重物
  • 不含RNase的的水(200 ml)
  • 0.05 M NaOH(200 ml)
预先浸泡滤纸和印迹膜
  1. 以每边大于凝胶1 mm的尺寸,切取一片尼龙膜和两片Whatman 3 mm滤纸。
  2. 切取比凝胶长两倍的Whatman纸,确保凝胶下的滤纸长度能够接触到转印盘两侧的底部。
  3. 将尼龙膜在水中润湿。之后将Watman纸与尼龙膜共同浸泡于20xSSC溶液中1–2分钟。
毛细管转印
  1. 使用1公升20xSSC将缓冲液托盘填满。将玻璃或有机玻璃板放置于托盘内或支持物的顶端。
  2. 将预先浸泡的两倍长度滤纸放置于玻璃板或有机玻板之上,使其能够接触到转印盘的两端底部。通过使用移液管在表面来回滚动数次,赶去滤纸与平板之间存在的任何气泡。
  3. 在电泳后立即将凝胶在200 ml不含RNase的水中浸泡10分钟,之后再于200 ml 0.05 M NaOH中孵育15分钟,并在浸泡过程伴随轻柔的摇动。最后于200 ml 10xSSC中浸泡凝胶10分钟以中和NaOH。
    小贴士:将20xSSC 2倍稀释,以获得10xSSC溶液。
    小贴士:凝胶中包含变性RNA的甲醛。甲醛有毒。请在通风橱内进行操作以避免吸入甲醛。佩戴手套并采取适当的安全预防措施。
  4. 将凝胶朝下放置于平板滤纸之上。
  5. 在凝胶上方放置一张塑料薄膜。使用足够大的薄膜以覆盖整个平板上的滤纸表面。 使用洁净的解剖刀或刀片,小心地切割凝胶周围的塑料薄膜。之后移去凝胶上方的塑料薄膜而保留凝胶周围的薄膜。这项操作能够确保转印缓冲液仅通过凝胶进行转印移动,而不会在凝胶周围发生转移。
  6. 将预先浸泡的尼龙膜放置于凝胶之上,覆盖整个凝胶表面。尼龙膜一旦放置好就不要再进行移动。将一根移液管在表面来回地轻柔滚动数次,以去除尼龙膜与凝胶之间的任何气泡。
  7. 将两块预先浸泡的Whatman 3mm滤纸放置于尼龙膜表面。再次将移液管于表面来回地轻柔滚动数次,以去除任何气泡。
  8. 在滤纸顶端再放置15–20 cm厚的干燥纸巾。
    小贴士:请确保凝胶周围的塑料薄膜避免了干燥纸巾与凝胶下方的湿润滤纸及转印缓冲液的直接接触。注意不要让纸巾垂下,因为它们会导致液体从凝胶周围流过而不再通过凝胶。
  9. 在纸巾上放置第二块玻板或有机玻璃板。并在平板上方放置1 kg的重物。
  10. 转印过程需持续12–18小时。
    小贴士:在转印过程中至少移去湿润的纸巾一次,并更换为干燥的纸巾。必要时向缓冲液盘中加入更多的转印缓冲液。
    小贴士:凝胶转印过程中其中所含的甲醛将会扩散出来。甲醛有毒。请在通风橱内进行转印操作,以避免吸入甲醛。在操作过程中穿戴手套并采取适当的安全预防措施。
固定RNA印迹
  1. 转印完成之后,去除重物,纸巾和两片滤纸。将凝胶和尼龙膜共同翻转过来,使凝胶面向上放置于一篇干燥滤纸之上。使用圆珠笔或较软的石墨铅笔在尼龙膜上标记出凝胶泳道的位置。之后剥离并弃去凝胶。
    小贴士:请确保在移去凝胶之前在尼龙膜上标记好凝胶泳道的位置!如果忘记进行此项标记,您将无法再确定每一具体泳道的位置。
    小贴士:凝胶中的大部分甲醛都被转移至纸巾和上层滤纸当中。
    小贴士:请遵照您所在机构的废品处理准则对废物进行丢弃。
  2. 在100–200 ml 10xSSC溶液中润洗尼龙膜1分钟。
    小贴士:将20xSSC溶液稀释为10xSSC溶液。这一洗脱步骤将去除任何粘附于RNA印迹上的琼脂糖成分。
  3. 通过烘烤(第4步)或紫外线——交联法(第5步)将RNA印迹固定下来。
    小贴士:紫外线——交联法一般能提供比烘烤法更高的灵敏度,从而获得更好的结果。不过想获得适度的交联,需要预先优化系统条件。
  4. 通过烘烤来固定RNA时,首先在一片干燥的滤纸上风干RNA印迹膜,之后将其放置于两片滤纸之间。在80°C的真空烘箱内烘烤30分钟至2个小时。
  5. 通过紫外线——交联法固定RNA时,将潮湿的印迹膜附有RNA的一侧以固定时长暴露于紫外照射(例如使用一台紫外透射仪)下。
    小贴士:为了确定紫外照射的合适条件,首先须对整个系统进行经验性的实验和优化。为了达到此目的,先使用已知RNA成分的样本制成含多个平行泳道RNA印迹膜。将此印迹膜切割为含单一泳道的条块,并分别照射从0.5至5分钟内的不同时长。杂交完成后确定何种杂交时间所获的信号最佳。请确保对每次实验使用同样的条件(紫外线波长,与紫外光源的距离)。此外,整个系统应定期进行校准,以保证紫外照射的强度不会发生改变。
    小贴士:紫外线会损伤眼睛和皮肤。请一直佩戴适当的眼部和面部防护装置。
  6. 如果制好的RNA印迹不会立刻使用,请使用塑料薄膜对其进行包裹,并储存于4°C条件下。

毛细管电泳

RNA分子的完整性对于基因表达分析实验极其重要,使用完整的RNA是获得有意义的实验数据的关键步骤。

背景

以往通过使用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳,获得28S:18S rRNA的比值,从而来评价RNA分子的完整性。这能产生一种确定的条带模式(4)。通常,凝胶上会显示两个分别对应28S rRNA和18S rRNA的条带,凝胶上还有其它的条带,对应更小的RNA分子。当28S:18S rRNA条带的比值≥2.0时,可认为RNA分子的质量很高。

但是,这种方法是易变的;因为这是一种依赖于人肉眼的主观检测。因此,这种方法不能在不同的实验室之间,甚至是同一个实验室内部标准化。

毛细管电泳RNA分离技术的引入,为自动化,标准、清晰的评价RNA样品的完整性,打下了基础。

毛细管电泳可以根据分子的大小快速分离核酸。与传统的琼脂糖凝胶电泳不同,这种分离是在即用型胶盒中的毛细管中进行的。样品自动载入到单独的毛细管中,然后外加电压。带负电荷的核酸分子在毛细管中,向带正电荷的一端迁移。与琼脂糖凝胶电泳类似,低分子量的分子迁移比高分子量的分子要快。当核酸分子沿毛细管迁移时,经过一个检测器,可以检测并且测定荧光信号。通过光电倍增管将荧光信号转变成电信号,并传至电脑上,以便进行进一步的处理。

RNA完整性参数

可以通过很多方法测定RNA的完整性,包括RNA质量指标(RQI),RNA质量评分(RQS)和RNA完整性计数(RIN)。RIN是目前最为常用的方法。

RNA完整性计数(RIN)

RNA完整性计数是帮助科学家估计整个RNA样品完整性的一种软件算法。相应软件会自动为一个真核细胞总RNA样品的完整性计数赋值。

这种方法中,样品的完整性不再通过核糖体RNA条带的比值来确定,而是通过RNA样品的整个电泳轨迹来确定。这考虑了降解产物的存在与否对结果的影响。这种方法可以帮助解析电泳图谱,实现对样品的比较,并确保实验的可重复性。所得到的RIN值,与样品的浓度、使用的工具和分析方法无关,因此是一种真正的评价RNA物理完整性的标准。

RIN可提供:

  • 对RNA完整性的数值评价
  • RNA样品的直接比较(比如,不同实验室之间的比较)
  • 实验的可重复性(比如,如果一个RIN值适用于微阵列实验,那么只要使用相同的组织和提取方法得到的样品,相同的RIN值总能适用于相似的实验)
应用RIN

首先,RIN值必须得到验证。这可以通过,将RIN值与一个特定的下游实验(比如微阵列分析或者RT-PCR)相关联来实现。这个关联步骤可以用来确定,成功的下游实验和失败的实验之间的RIN阈值。如果可能的话,这一步骤可基于已知的Bioanalyzer实验数据集上进行。确定阈值之后,这个阈值就可以用于标准的RNA质控流程。具有高于阈值的RIN值的样品,能通过质量控制检测,而舍弃那些低于阈值的样品。当重要的实验参数改变(包括,研究其他物种,使用其他类型的微阵列,使用不同的探针集等)时,应重复RIN验证的关联步骤。

从RNA中去除基因组DNA污染

目前还没有哪一种纯化步骤能保证RNA中不含DNA,即使在琼脂糖凝胶电泳上检测不到DNA。对于低丰度目标序列的研究,残留的DNA污染物对样品的任何干扰,都能够通过real-time RT-PCR 对照实验检测到,在这些对照实验中,PCR反应之前不加入逆转录酶。为了避免real-time RT-PCR 实验中DNA的干扰,我们推荐设计与内含子的剪接位点相结合的引物,这样就避免了基因组DNA的扩增。也可以使用一些商业化的试剂盒,在cDNA合成时,去除基因组DNA。对于一些灵敏程度更高的应用,推荐使用不包含核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶,对经过纯化的RNA进行消化,去除DNA。

参考文献

  1. Alberts, B., et al. (2002) Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York: Garland Publishing, Inc.
  2. Ausubel, F.M. et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons.
  3. Wilfinger, W.W., Mackey, M., and Chomczynski, P. (1997) Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 22, 474.
  4. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.

资源与支持

您无权限查看此资源

DNA
1
Isolation and quantification of genomic DNA from different sample sources and plasmid DNA. How to make and transform competent cells, how to culture and handle plasmid-containing cells, and commonly used techniques for analysis of genomic DNA.
浏览
产品介绍与指南
1
PCR
1
This section provides a comprehensive guide to PCR. It also includes guidelines and suggestions for maximizing results from your PCR.
浏览
全基因组扩增
1
Whole genome amplification was developed as a way of increasing the amount of limited DNA samples. This is particularly useful for forensics and genetic disease research, where DNA quantities are limited, but many analyses are required. Various WGA techniques have been developed that differ both in their protocols, amplification accuracy, and ease-of-use.
浏览
二代测序
1
Following the completion of the human genome project, the high demand for low-cost sequencing has given rise to a number of high-throughput, next-generation sequencing (NGS) technologies. These new sequencing platforms allow high-throughput sequencing for a wide range of applications.
浏览
表观遗传学
1
The study of epigenetic mechanisms and DNA methylation has become increasingly important in many areas of research, including DNA repair, cell cycle control, developmental biology, cancer research, identification of biomarkers, predisposition factors, and potential drug targets.
浏览
转染
1
Transfection — the delivery of DNA or RNA into eukaryotic cells — is a powerful tool used to study and control gene expression.
浏览
蛋白质
1
As well as providing some general background into proteins and their biology, this guide covers commonly used protocols for expression, purification, analysis, detection and assays.
浏览
动物细胞培养
1
Useful hints for culturing animal cells (i.e., cells derived from higher eukaryotes such as mammals, birds, and insects). The guide covers different types of animal cell cultures, considerations for cell culture, and cell culture protocols.
浏览