表观遗传学实验方案和应用

Epigenetics
这里讨论表观遗传学的机理、DNA甲基化、以及相关研究应用。
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关于表观遗传学机制和DNA甲基化的研究在很多领域变得越来越重要,如DNA修复、细胞周期控制、发育生物学、癌症研究、生物标志物、易感因素和潜在药物靶点的确定。

基于亚硫酸氢盐转化的DNA甲基化分析

将DNA暴露在亚硫酸氢盐中能导致未甲基化的胞嘧啶迅速的脱氨基转换成6-磺酰基脲嘧啶。在高pH值情况下,6-磺酰基脲嘧啶会脱磺酰基转变成脲嘧啶并最终通过序列扩增转换成胸腺嘧啶。而甲基化的胞嘧啶不会发生这种转变。将这种转化过的DNA与初始的未转化的序列进行比对,能确定CpG岛上甲基化位点的位置和丰度的细节。高分辨率溶解分析(HRM)是一种快速的筛选工具,能精确的检测亚硫酸氢盐转化的DNA上的CpG岛甲基化状态的变化。Pyrosequencing能定量的描述单个CpG位点的甲基化的百分比。可用于大尺度甲基化分析的其它可供替代的方法还包括甲基化特异性PCR(MSP),这种方法具有较高的特异性和灵敏度。这些分析方法都有商业化的试剂盒。

基于限制性酶消化的DNA甲基化分析

这种方法可以不使用亚硫酸氢盐修饰而研究单独基因上或者疾病或通路相关的基因panel上的CpG岛的甲基化状态。这种方法依赖于两种不同的限制性内切酶对于目标序列不同的剪切方式。这两种酶在发挥其生物活性时,对各自识别序列中是否有甲基化胞嘧啶的要求不同。每一种酶消化之后残留的DNA的相对量可以通过real-time PCR进行定量分析,从而得到单独基因甲基化状态以及gene panel的甲基化情形的可靠计算数据。

表观遗传学相关的DNA-蛋白相互作用的体内分析

染色质免疫共沉淀(ChIP)方法是分析活细胞中染色质DNA与转录因子、共调节因子、修饰组蛋白、染色质重塑蛋白以及其它核因子相互作用的强大的多功能方法。这种方法可用于对DNA–核蛋白的动态相互作用进行活体分析。这种相互作用在表观遗传学中的基因表达调控中起到了非常重要的作用。

一种新型的表观遗传学标志物:5-羟甲基胞嘧啶(5 hmC)

5-羟甲基胞嘧啶是哺乳动物基因组DNA中一种重要的表观遗传学标志物。5-羟甲基胞嘧啶是最近才发现的一种碱基修饰。它是经TET加氧酶家族(1,2)催化5-甲基胞嘧啶形成的。

它被称为“第六种DNA碱基”,关于这种碱基的所扮演的角色有很多推测,但是它的准确的生物学功能还没有阐明。初步的结果认为5-羟甲基胞嘧啶可能具有与5-甲基胞嘧啶不同的重要功能。目前的证据显示5-羟甲基胞嘧啶可能代表了一种DNA去甲基化的新途径,这种途径涉及到将羟甲基化胞嘧啶转换成胞嘧啶的修复机制。这可能在表观遗传学领域有非常重要的含义,能加速表观遗传学的研究。

甲基化特异性PCR(MSP)的引物设计

甲基化特异性PCR(MSP)是一种要求很高的应用。为了得到可靠的结果,它要求能高度特异性的区分胞嘧啶和亚硫酸氢盐转化试验中由甲基化和未甲基化的胞嘧啶转化得到的胸腺嘧啶。

甲基化特异性PCR的引物设计通常比较困难,因为这种引物的设计要求覆盖几个CpG位点。这样就不能检测CpG岛里面单独的CpG甲基化。

引物在其序列里面需要包含至少一个CpG位点,并且最好位于它们的序列中远离3’端的位置,以便能最大程度的区分甲基化和未甲基化的DNA。

引物在其序列中应该包含足够的不位于CpG岛上的胞嘧啶,以便仅扩增那些被亚硫酸氢盐修饰过的DNA。包含有更多的不位于CpG岛上的胞嘧啶的引物更加适用。

甲基化DNA(M pair)和未甲基化DNA(U pair)的引物应该在其序列中包含相同的CpG位点。比如,M pair的正向引物包含这样的序列:ATTAGTTTCGTTTAAGGTTCGA,那么U pair的正向引物必须也包含这两个CpG位点,比如,ATTAGTTTTGTTTAAGGTTTGA;尽管它们可能在长度和起始位点上有差别。M pair和U pair最好具有相似的退火温度。

对照DNA

在进行甲基化分析的时候,应该进行对照试验,比如,在进行甲基化特异性PCR(MSP)时,应该保证PCR的引物能特异性的检测亚硫酸氢盐转化的甲基化和未甲基化的DNA。

为了进行对照实验,需要亚硫酸氢盐转化的甲基化的DNA、亚硫酸氢盐转化的未甲基化的DNA和基因组DNA。应该使用每一种类型的DNA来判断PCR的特异性。比如,甲基化DNA特异性的引物对于甲基化的对照DNA仅显示一个信号(参见下表)。

除此之外,基因组DNA还可用于测定亚硫酸氢盐反应中亚硫酸氢盐转化的效率。

预期PCR结果与对照
DNA类型 未甲基化的靶基因的引物(PCR 1) 未甲基化的靶基因的引物(PCR 2) 甲基化的靶基因的引物 (亚硫酸氢盐转化) (PCR 3)
未甲基化的对照DNA PCR产物 无PCR产物 无PCR产物
未甲基化的对照DNA(亚硫酸氢盐转化) 无PCR产物 PCR产物 无PCR产物
甲基化的对照DNA(亚硫酸氢盐转化) 无PCR产物 无PCR产物 PCR产物
无模板对照 无PCR产物 无PCR产物 无PCR产物

参考文献

  1. Kriaucionis, S., and Heintz, N. (2009) The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science 324, 929.
  2. Tahiliani, M., et al. (2009) Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science 324, 930.
  3. Ito, S., et al. (2010) Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification., Nature 26, 1129.
  4. Jin, S.G., Kadam, S., and Pfeifer, G.P. (2010) Examination of the specificity of DNA methylation profiling techniques towards 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Nucleic Acids Res. 38, e125.
  5. Huang, Y., et al. (2010) The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One 26, e8888.
  6. Nestor, C., et al. (2010) Enzymatic approaches and bisulfite sequencing cannot distinguish between 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in DNA. Biotechniques 48, 317.

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