基因组DNA和质粒DNA的分离和定量注意事项
本部分介绍从不同样本来源分离和定量基因组DNA,以及分离和定量质粒DNA的注意事项。此外,本部分内容还涉及通用的质粒DNA处理操作,包括如何制备和转化感受态细胞,如何培养和处理含有质粒的细胞,以及一些基因组DNA分析通用的技术。

何为DNA?

基因组DNA

基因组DNA构成了生物体的完整遗传信息。几乎所有生物体的基因组组成都是DNA,仅有的例外是具有RNA基因组的部分病毒。基因组DNA分子通常较大,且在多数生物体中是以DNA-蛋白质复合物(即所谓的染色体)的存在。不同生物体的染色体的尺寸、数量,以及基因组DNA的性质各异。病毒DNA基因组相对较小,可以为单恋或双链,线状或循环状。所有其它生物体的基因组都是双链DNA形式。细菌具有单个循环状的染色体。在真核生物体内,多数基因组DNA位于细胞核内(核内DNA),构成多条不同尺寸的线状染色体。此外,在真核细胞的线粒体内,以及植物和低等真核生物的叶绿体内,也额外含有基因组DNA。这一类DNA通常为环状分子,以这些细胞器内的多拷贝形式存在。

不同基因组DNA的大小和分子量
生物体 每个单倍体基因组的碱基数 基因组的分子量(道尔顿) 染色体数量
SV40 5243 3.4 x 106
F174 5386 3.5 x 106
Adenovirus 2 35,937 2.3 x 107
Lambda 48,502 3.2 x 107
Escherichia coli 4.7 x 106 3.1 x 109 x = 1
Saccharomyces cerevisiae 1.5 x 107 9.8 x 109 2x = 32
Dictyostelium discoideum 5.4 x 107 3.5 x 1010 x = 6
Arabidopsis thaliana 7.0 x 107 4.6 x 1010 2x = 10
Caenorhabditis elegans 8.0 x 107 5.2 x 1010 2x = 12
Drosophila melanogaster 1.4 x 108 9.1 x 1010 2x = 8
Gallus domesticus (chicken) 1.2 x 109 7.8 x 1011 2x = 78
Mus musculus (mouse) 2.7 x 109 1.8 x 1012 2x = 40
Rattus norvegicus (rat) 3.0 x 109 2.0 x 1012 2x = 42
Xenopus laevis 3.1 x 109 2.0 x 1012 2x = 36
Homo sapiens 3.3 x 109 2.1 x 1012 2x = 46
Zea mays 3.9 x 109 2.5 x 1012 2x = 20
Nicotiana tabacum 4.8 x 109 3.1 x 1012 2x = 48
Adapted from references 1 and 2.

基因组DNA含有基因,即对蛋白质或RNA进行编码的不连续区域。基因包含编码DNA序列,以及控制基因表达的相关调控元件。真核基因还含有称为内含子的非编码区域。不同生物体的基因数量存在很大差异。编码DNA仅占真核生物基因组DNA的一小部分:大量的DNA是不编码的,其中的多数由重复序列构成。部分不编码DNA具有结构和调控功能;但多数此类DNA的功能仍多半处于未知阶段。不同生物体细胞内每个遗传位点的拷贝数目(又称倍体摂)也存在差异。有性生殖的生物体的体细胞通常为二倍体,即具有两套类似的染色体,因此各个遗传位点也具有两份拷贝;而生殖细胞则是单倍体,仅具有各个染色体的一份拷贝。原核细胞为单倍体。部分植物为多倍体,如现代小麦就是六倍体(每个染色体六份拷贝)。

质粒DNA

细菌质粒为双链闭合环状DNA分子,大小为1 kb 到大于200 kb不等。细菌质粒已在一系列细菌种属中发现,它们是独立于细菌染色体进行遗传和复制的附加遗传单位。但想要成功转录和复制,它们仍然要依赖宿主提供的酶和蛋白质。

质粒中通常含有编码(在部分环境下)有利于宿主细胞的酶的基因。这些编码的酶可能会参与抵制环境内检出的毒素(例如,复杂的有机复合物)或者细菌自身产生的毒素,或生成相应的抗体。 

质粒DNA纯化后,可用于测序、PCR、蛋白表达、转染以及基因疗法等一系列下游应用。

DNA可采用许多种方法进行纯化,但下游应用真正决定了DNA的纯化方法。除了采用自制方法(例如,CsCl离心梯度纯化法)进行分离外,许多供应商还提供了DNA提取试剂盒。3种最通用的DNA提取试剂盒的特征如下表所示。

通用DNA提取技术特性
阴离子交换 二氧化硅膜技术 磁性颗粒技术
技术原理 固相阴离子交换色谱法 选择性吸附二氧化硅膜 在受控离子条件下结合磁性二氧化硅颗粒
操作步骤 结合:变化的盐度和pH
洗脱:变化的盐度和pH
乙醇沉淀
结合:高盐
洗脱:低盐
即用型洗脱液
结合:高盐
洗脱:低盐
即用型洗脱液
优势 可纯化出超纯的转染级DNA,以便在敏感应用中获得最优的实验结果 可纯化出可供大多数下游应用使用的高纯度核酸 可纯化出可供大多数下游应用使用的高纯度核酸
快速,且费用不高 快速,且费用不高
不携带二氧化硅浆料,不进行乙醇沉淀 易于实现自动化;不进行乙醇沉淀

阴离子交换法纯化出的DNA的纯度和生物活性,至少相当于两轮CsCl梯度纯化,但用时仅相当于后者的零头而已。纯化出的核酸具有最高品质的质量,是敏感的下游生物学应用(如转染、显微注射、测序和基因疗法研究)的理想选择。

二氧化硅膜技术纯化出的高纯度核酸适于大多数分子生物学和临床研究应用,如限制消化、连接、标记、扩增,以及放射性和荧光测序。

磁性颗粒技术纯化出的高纯度核酸适于临床和兽医研究中的大多数分子生物学应用,如限制消化、连接、标记、扩增,以及放射性和荧光测序。磁性颗粒技术常常可以实现自动化,以快速、经济地开展核酸纯化操作。

DNA研究:良好的实验室规范

处理DNA

DNA是一种相对稳定的分子。但应避免在DNA溶液中引入核酸酶,因为此类酶会造成DNA降解。基因组DNA由超大的DNA分子构成,因此较为脆弱,极易被破坏。为确保基因组DNA的完整性,应避免进行过多和过于粗糙的移液和涡旋振荡操作。DNA储存在水中时,极易酸性水解,因此应将其储存在TE缓冲液中,详见下表。

TE Buffer, pH 7.4
成分 体积
1 M Tris×Cl, pH7.4 10 ml
0.5 M EDTA, pH 8.0 2 ml

核酸换算:DNA

DNA的分子量换算
  • 双链DNA分子的MW(钠盐) = (碱基对数目) x (662 分子量/碱基对)
  • 单链DNA分子的MW(钠盐) = (碱基对数目) x (331 分子量/碱基对)
  • DNA核苷酸酶的MW(钠盐,pH ≥7):
  • MW = (NA x 335.2) + (NC x 311.2) + (NC x 351.2) + (NT x 326.2) + P

其中NX = 寡核苷酸内各核苷酸残基数目(各核苷酸列明的MW为(在相应钠盐条件下)融合到寡核苷酸内的相应核苷酸的MW)
对于脱磷酸化寡核苷酸:P = –84.0
对于磷酸化寡核苷酸:P = 40.0

DNA的分子换算

DNA的分子换算请见表:微克DNA换算和皮摩尔DNA换算。蛋白质/DNA换算请见表:蛋白质/DNA换算。

微克DNA换算
1 µg pmol 分子
20 b寡聚核苷酸 152 9.1 x 1013
1000 bp DNA 1.52 9.1 x 1011
pUC 19 DNA (2686 bp) 0.57 3.4 x 1011
pBR322 DNA (4363 bp) 0.35 2.1 x 1011
Lambda DNA (48,502 bp) 0.03 1.8 x 1010
皮摩尔DNA换算
1 pmol 微克
20 b寡聚核苷酸 0.0066
1000 bp DNA 0.66
pUC 19 DNA (2686 bp) 1.77
pBR322 DNA (4363 bp) 2.88
Lambda DNA (48,502 bp) 32.01
蛋白质/DNA换算
1 pmol DNA
10,000 Da 270 bp
30,000 Da 810 bp
100,000 Da 2.7 kb
1 kb of DNA编码333 氨基酸@ 3.7 x 104 Daltons.

分光光度法测定DNA浓度

DNA和RNA的浓度应通过分光光度计测定260 nm (A260)下的吸光度来测定。出于准确度需要,260 nm下的吸光度读数应将至0.15到1.0之间。

在10 mM Tris•Cl、pH 8.5条件下,纯净的DNA的A260/A280比率为1.8–2.0之间。

A280处的强吸光度会造成较低的A260/A280 比率,这表示有蛋白质等污染物存在。

在270 nm和275 nm处的强吸光度则表示存在污染物苯酚。

在325 nm处的吸光度表示很可能存在溶液或脏污的器皿造成的污染。

260 nm处吸光度的分光光度换算
1 A260 unit 浓度 (µg/ml)*
dsDNA 50
ssDNA 33
寡聚核苷酸 20–30
* 此关系仅在中性pH下进行测定时有效,且基于标准1 cm路径。相对于基准1进行调整。

基因组DNA提取之前的样本储存

起始材料的质量影响着分离的DNA的质量和产量。纯化来自于新鲜采集的组织和细胞的基因组DNA时,可以达到最高的DNA产量和质量。如果样品在采集之后无法即时处理,则可将其储存在可保留DNA完整度的条件下。总的来说,如果样品,尤其是动物样品,在未经处理的情况下在2–8°C或–20°C条件下储存,会造成基因组DNA的产量下降。此外,应避免对冻存样品反复冻融,因为这会造成基因组DNA大小变小,同时还会造成病原DNA(例如,病毒DNA)的产量下降。我们将在下文讨论不同起始材料建议的储存方法。

血液

将要储存的血液样品中应添加抗凝剂。例如,采用肝素或EDA处理的血液样本可在2–8°C下储存数天,或在–20°C或–80°C下储存数周。此外,采用ACD溶液B (0.48%柠檬酸,1.32%柠檬酸钠,1.47%葡萄糖;每6 ml血液使用1 ml)处理的血液样本,在2–8°C下至少可储存5天,在–20°C下至少可储存1个月。如需长期储存,可准备血液细胞核,并在–20°C下储存。

其它临床样本

大多数生物液(例如,血浆、血清和尿液)和粪便样本可在2–8°C下储存数小时。如需长期储存,建议在–20°C或–80°C下冰冻。拭子可在室温下干燥储存。

福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)是另一种样本储存方法,尤其适用于临床组织样品。根据组织类型,生物分子在收集后发生分解、诱导或改性的速度存在差异。因此,组织切除和固定的操作步骤应尽可能简短、快捷。

组织的固定涉及将样本放入福尔马林溶液的步骤,而后者的组分则存在各种差异(常用的10%福尔马林溶液含有3.7%的甲醛和1–1.5%的甲醇)。由此引发的化学反应导致生物分子之间发生交联,包括核酸之间、蛋白质之间以及核算和蛋白质之间的交联。为获得最优的固定结果,应采用中性缓冲的福尔马林溶液,而非未缓冲或酸性的福尔马林溶液。中性缓冲液可减缓福尔马林的降解,目前可以确信的是后者降解的产物会对核酸质量造成一定程度的破坏。

为确保最优的固定效果,福尔马林和组织的体积比应至少达到10:1。在处理较小的组织样本(如针穿刺吸取组织活检样本)时,这一目标很容易实现。但在处理体积较大的组织样本时,用于组织固定的福尔马林溶液则可能会出现不足。在此情况下,应将组织切片之后再进行福尔马林固定。为避免过度固定(overfixation),组织固定时间应不超过24小时。

经过福尔马林固定后,组织样本将要包埋在石蜡中,这一过程包括几步。第一步脱水,即采用酒精(通常为乙醇)取代水。接下来两步为:透明,即采用二甲苯和二甲苯替代物取代酒精;浸蜡:即用石蜡取代二甲苯。最后一步是包埋,即整个组织用石蜡包裹起来。在浸蜡之前,确保组织样本已完全脱水非常重要,因为残留的水分会造成样本降解。为避免酒精和二甲苯因之前使用而可能携带水分,建议始终采用新鲜的酒精和二甲苯。为确保自FFPE样本恢复可用的DNA时能获得最佳恢复效果,应采用较低的解冻温度解冻石蜡。此外,应避免采用含有蜂蜡等添加剂的石蜡,因为这一类添加剂可能会干扰生物分子的恢复。

动物组织

新鲜采集的组织可以立即冰冻,并在–20°C、–80°C下,或者液氮中储存。裂解的组织样本可在室温下,在适宜的裂解液中储存数月。

动物和人体组织也可固定储存。我们建议您采用酒精和福尔马林等固定剂;但如果组织在福尔马林中长期储存,会导致DNA出现化学修饰。如果需要从组织中分离DNA,建议不要采用可能会引起交联反应的固定剂,如锇酸。此外,还可从石蜡包埋的组织中分离DNA。

动物、酵母和细菌细胞培养

离心处理采集的细胞培养液,吸弃上清液,然后在–20°C或–80°C下储存细胞。此外,还可准备动物细胞核并在–20°C下储存。

植物组织

在不影响DNA质量或产量的前提下,大多数植物属的新鲜叶子和针叶最多可在4°C下储存24小时。通常意义上讲,如果样本计划的储存时间超出24小时,则应在–80°C下储存。即便如此,仍有部分样本(如树芽)可在4°C下储存数天。组织在4°C下储存时,为避免脱水,应避免在密闭的容器内储存。较大的样本(如,树枝)则可储存在含有一块湿润的纸巾的塑料袋中。

如果冻存样本的方法不符合实际情况,则可采用大量方法干燥植物组织,例如硅胶、食品脱水剂或冻干机(3)。为防止DNA降解,应至少在24小时内使材料彻底干燥。如需长期储存,干燥后的样本应在黑暗、室温、干燥或气密条件下储存。根据样本的处理方式,植物标本和法医学样本中的DNA可能会存在不同程度的降解。破碎过的植物材料可在室温下,在适宜的裂解液中储存数月。

真菌材料

菌丝应直接从培养皿或液体培养液中采集。如从液体培养液中采集,在进行DNA分离和储存前,应采用离心法沉淀细胞,并吸弃上清液。采集的样本可以直接冷冻或冻干,并在–80°C下储存。

基因组DNA提取前的样本破碎

进行所有的基因组DNA分离步骤前,必须要进行彻底的细胞壁、细胞质膜以及细胞器的破碎和裂解。破碎不完全,会导致产量大幅度减少。

破碎方法
裂解液

破碎通常包括含有去污剂(用于破坏细胞膜)和蛋白酶(用于消化蛋白细胞成分)裂解液的应用。所选的蛋白酶取决于所用的裂解液。为有效裂解,部分样本需要采取额外处理。

使用转子-定子匀浆机破碎

根据的样本粗燥程度,转子-定子匀浆机可在5–90秒内将动物和植物组织彻底破碎。转子以极高的转速旋转,以湍流和机械式剪切组合作用使样本破碎。应选用尺寸适当的容器,保持匀浆器探头浸入,同时将浸入的探头置于离心管的一侧,从而将样本的泡沫量降至最小。定子-转子匀浆机现具有不同的尺寸规格,可采用不同规格的探头。直径为5 mm和7 mm的探头适用于体积不超过300 µl的应用,可在微量离心管中匀浆。直径为10 mm或更高的探头则需要更大的离心管。

使用研磨机破碎

采用研磨机破碎时,样本将在存在研磨珠的情况下高速搅拌。研磨珠与样本不断碰撞过程中,剪切并粉碎样本,同时进行破碎。破碎效果受以下因素影响:

  • 研磨珠的大小和成分
  • 缓冲液和研磨珠的比率 
  • 起始材料的量
  • 搅拌器的转速和配置
  • 崩解时间 

细菌最适宜采用的研磨珠为0.1 mm(平均直径)的玻璃珠,酵母和单细胞动物细胞最适宜采用的是0.5 mm的玻璃珠,动物组织最适宜采用的是3–7 mm的不锈钢珠,植物和真菌组织最适宜采用的是3–7 mm的不锈钢柱或或碳化钨珠。必须要采用高浓度硝酸对玻璃珠进行洗涤预处理。此外,也可采用市售的酸洗过的玻璃珠子。所有其它破碎参数则必须根据各种应用,依照经验确定。

采用研磨皿和研磨棒破碎

如要用传统研磨皿和研磨棒进行破碎,则应用液氮即时冰冻样品,并在液氮环境下研磨成细末。将上清液(组织粉末和液氮)移到液氮冷却的适宜尺寸的试管中,在样本不融解的情况下让液氮蒸发。添加裂解液,然后尽可能快速地进入分离操作。

从不同样本源分离基因组DNA的特别注意事项

部分样本源中含有可导致DNA分离和分析过程出现问题的物质。在处理此类样本源时,需要采取特别注意事项。本部分将讨论处理一系列样本源时的注意事项。

血液

我们会定期采集人类血液样本以供临床分析应用。血液中含有大量可能干扰下游DNA分析的酶抑制剂。此外,诸如肝素和EDTA等通用抗凝剂还会干扰下游检测。从血液中分离DNA时,需要具备可提供不含污染物和酶抑制剂的优质DNA的方法。

在动物体内,鸟类、鱼、青蛙的红细胞(红血细胞)含有核酸,因而也含有基因组DNA,而哺乳动物的红细胞中则不含这些成分。由于健康的哺乳动物血液中所含的红细胞要比含有核酸的白细胞(白血细胞,包括淋巴细胞、单核白细胞和颗粒性白细胞)数量超出近1000倍,在DNA分离之前去除红细胞可提高DNA产量。为此可结合采用几种方法。其中的一种方法是选择性溶解红细胞:在低渗缓冲液条件下,红细胞要比白细胞更易低渗休克和快速破裂。另一种方法是Ficoll密度梯度离心法,可回收单核细胞(淋巴细胞和单核细胞)并去除红细胞。此技术还可去除粒细胞。第三种方法则是通过在室温下对全血进行3300 x g离心10分钟,制备全血白细胞富集级分(即所谓的白细胞层)。离心之后,会分成三层:上清层为质粒;中间层为白细胞层;底层含有浓缩的红细胞。

血液样本,包括哪些经过红细胞去除处理的血液样本,可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。除动物基因组DNA外,也可从血液样本中分离病毒和细菌DNA。

其它临床样本

进行DNA分离时,多数生物液可采用与血液样本相同的方式进行处理。从粪便样本中分离DNA较为困难,这是因为粪便中通常含有很多可能降解DNA、抑制下游酶反应的成分。

动物组织和细胞培养液

动物细胞培养液和多数动物组织可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。为帮助裂解,新鲜或冻存的样本应切成小块。在裂解前使用匀质机或磨皿和研磨棒进行机械破碎,可缩短裂解时间。骼肌肉、心脏和皮肤组织中含有丰富的收缩蛋白、结缔组织和胶原蛋白,为确保能采用蛋白酶或蛋白酶K进行完整消化,在处理这一类组织时要格外小心。

对于固定后的组织,在裂解前应去除固定剂。通过用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤组织,可去除福尔马林成分。从石蜡包埋的组织中去除石蜡的方法与此类似,即先采用二甲苯提取,然后采用酒精洗涤。

酵母细胞培养液

为消化细胞壁,酵母细胞培养液必须先用溶壁酶或酵母裂解酶进行处理。处理后的去壁酵母细胞将采用离心法进行收集,然后使用裂解液和蛋白酶K或蛋白酶进行裂解。

细菌DNA

很多细菌细胞培养液可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。部分细菌,尤其是革兰氏阳性菌,则需要采用特殊的酶(例如溶菌酶或溶葡萄球菌酶)进行预孵育以裂解牢固坚固的多层细胞壁。

从大量的临床样本中,也可分离出细菌DNA。细菌细胞应从生物液中沉淀下来,并从细菌细胞培养液中分离DNA。在进行细菌细胞离心之前,拭子样本应采用杀真菌剂进行预处理。

DNA病毒

在临床应用中,病毒DNA通常(当然不是全部)分离自无细胞的体液,数量非常少。在通过超速离心、超滤或沉淀法DNA分离之前,可能需要对病毒微粒进行浓缩处理。如果预期DNA产量非常低时,在DNA分离过程中,可能还必须要添加载体DNA。制备整合的病毒DNA时,采取的操作步骤与从相关样本中分离基因组DNA的步骤相同。诸如M13和lambda这一类的噬菌体,分离自感染的培养液。在分离病毒DNA之前,必须通过离心方法从培养液中去除细菌细胞。

植物

从植物材料中分离DNA时面临着特殊的挑战,通用的技术往往需要适当调整之后才能用于处理植物样本。部分植物代谢物具有类似于核酸的化学性质,难以从DNA制备物中去除。纯化操作引入的共纯化代谢物和污染物(如盐或苯酚)可能抑制酶促反应或造成分光光度法测定偏差和凝胶移位。

采用在不会诱发高水平植物代谢的条件下生长的植物,通常可以改善DNA分离效果。由于植物之间存在巨大的差异,很难笼统地说明适宜采用的生长条件。但仍有一个基本适用的准则,即在条件允许的情况下,尽量使用健康、年轻的组织。年轻组织的DNA产量通常要高于年老的组织,这是因为年轻组织所含的细胞数量通常要多过同等数量的年老组织。此外,同等重量条件下,年轻组织的代谢量也更少。除此之外,很多“自制”DNA分离方法实验方案建议在采集前,先使植物在黑暗环境下生长1–2天,以防止积累较高水平的植物代谢物。

DNA处理:良好的实验室规范

大肠杆菌(E. coli)株系的生长

良好的微生物学技术总是有助于确保最佳的质粒DNA产量和质量。为在您的质粒制备过程中制备出绝佳的细菌培养液,需遵循以下步骤。

  1. 通过将来自于新鲜的划线筛选培养皿中的单个菌落接种到2–10 ml含有适当的抗生素的LB培养基中,制备酵母剂。充分振荡的(~300 rpm)的情况下,在37°C下生长约8小时。
    小贴士:请勿从已储存较长时间的甘油菌原液、琼脂穿刺培养液或培养皿上直接接种,因为这会造成质粒损失或突变。
    小贴士:通常可以在当天方便地生长发酵剂,以便在次日早晨收集过夜生长的较大的培养物。
  2. 按照适当的质粒纯化实验方案,将发酵剂按照1/500到1/1000的比例稀释到较大体积的筛选LB培养基中。
    为确保充分通风,应采用容量至少为培养物体积4倍的烧瓶。请勿使培养物的体积超出了实验方案建议的体积,否则会造成裂解不充分,降低制备物质量。 
  3. 在充分振荡(~300 rpm)的情况下,让培养物在37°C下生长12–16小时(参见下一部分说明)。 
  4. 接种12–16小时后,采集细菌培养液。这一时刻对应于从对数生长期到静止生产期的过渡阶段,此时细胞密度较高(3–4 x 109/ml)且细胞内的RNA含量较低。如过早采集,由于细胞密度相对较低,会造成质粒DNA的产量低于预期。如过晚采集,培养液会因过于老化而造成DNA降解,从而使质粒的质量和产量都较低。
    小贴士:培养物的生长依赖于若干因素,如宿主株系、质粒插入和拷贝数以及培养基等等。为确定某个体系的最佳采集时间,应通过测定OD600(参见下一部分说明)来监测细胞密度和培养物生长情况。
  5. 采集细菌培养物时,应在4°C下以6000 x g 的速度离心15分钟。将敞开的离心管倒置,去除所有痕量的上清液,直至培养基已全部倒出。此时余下的细胞即可遵照适当的质粒纯化实验方案,进行裂解操作处理。
    此外,也可在此时暂停裂解操作处理,将离心获得的细胞沉淀冷冻保存,之后再进行裂解操作。冷冻的细胞沉淀可在–20°C下保存数周。
大肠杆菌(E. coli)生长曲线

大肠杆菌(E. coli)培养液的生长曲线可分为几个阶段。第一阶段,迟缓期(lag phase),直接发生在将发酵剂接种到新鲜培养基中之后。在这一阶段,由于细菌仍在适应新鲜培养基,细胞分裂比较缓慢。之后细菌开始更快速地分裂,培养进入对数期(logarithmic (log) phase)(接种之后4–5小时),在这一阶段细胞数量呈指数增长。随着时间推移,培养基内可用的营养物逐渐被消耗,而细菌释放的代谢物还会细菌生长,培养变为饱和状态,进入稳定期(stationary phase)(接种后约16小时),在这一阶段细胞密度保持恒定。最后,随着细胞开始裂解,活性细菌细胞的数量开始下降,DNA出现部分降解,培养进入衰亡期(decline phase)

大肠杆菌(E. coli)的保存

根据预期的储存时间,可有多种方法储存大肠杆菌(E. coli)。甘油菌原液和穿刺培养液均可支持细菌长期储存,而琼脂盘则适于短期储存。各种方法的准备说明和有益贴士请见下文所述。

甘油原液

大肠杆菌(E. coli)株系可在–70°C下,在15%的甘油原液中储存数年。

细菌甘油原液的制备方法如下:

  1. 向2 ml螺旋小瓶中加入0.15 ml甘油(100%),然后采用高压灭菌法进行灭菌。
    小贴士:储存灭菌甘油的小瓶可分批准备,并在室温下储存备用。
  2. 向盛放预先灭菌的甘油的小瓶中添加0.85 ml对数期的大肠杆菌(E. coli)培养液。
  3. 充分涡旋振荡小管,确保细菌培养液和甘油均匀混合。
  4. 冰冻在酒精-干冰浴或液氮中,并在–70°C下储存。
    小贴士:请勿反复冻融甘油原液,否则会降低细菌活性。
    小贴士:对于较为珍贵的株系,建议分2个原液瓶储存。
    小贴士:从储存的株系恢复时,建议在筛选培养平板上对株系划线,以检查抗生素标记。
穿刺培养液

大肠杆菌(E. coli)株系还可以穿刺在半固态琼脂糖中储存至多1年。穿刺培养用于在实验室间运输和递送细菌株系。

穿刺培养液的准备方法如下:

  1. 准备并高压灭菌LB琼脂糖(含有0.7%琼脂糖的标准LB培养基)。
  2. 将LB琼脂糖冷却到50°C以下(手握的时候感觉到温度适宜),然后添加适当的抗生素。在琼脂糖仍处于液态时,在无菌条件下向2 ml螺口小瓶中添加1 ml琼脂糖,然后等待其凝固。
  3. 琼脂糖小瓶可分批准备,并在室温下储存备用。
  4. 采用灭菌直丝,从新鲜灭菌培养盘中挑起一片菌落,在半固态琼脂糖深入穿刺几次。
  5. 保持瓶帽稍稍松动,将小瓶在37°C下孵育8–12小时。
  6. 牢牢地密封上小瓶,在黑暗条件下储存,理想的储存温度为4°C。
  7. 从储存的株系恢复时,建议在筛选培养平板上对株系划线,以检查抗生素标记。
琼脂平板

划线的细菌平板可采用石蜡密封,在4°C下倒置储存数周。为确保筛选标记不会丢失,务必再含有适当抗生素的平板上进行细菌划线。

为获得分离效果良好的菌落,请按如下所述在琼脂平板上划线:

  1. 用火焰烘烤丝环,然后在空余的无菌琼脂平板上冷却。
  2. 使用一根丝环,跨过新鲜的琼脂平板一角在细菌培养液(来自于甘油原液、穿刺培养物或另一平板上的单个菌落)上划线。 
  3. 再次在火焰上烘烤丝环并冷却。使其穿过第一条划线,然后再次跨过平板的另一角划线。
  4. 重复上述步骤直至形成某种图案。
  5. 在37°C下倒置孵育12–24小时,直至菌落开始发育。
从细菌原液产出液体培养基

图所示为从储存的细菌原液获得进行质粒分离的液体培养液必须采取的步骤顺序。在使用前,务必要在筛选平板上对细菌原液进行划线,以检查确认它们适宜生长携带有适当抗生素抗性的健康菌落。此类原液中可能会含有制备所用培养液引起的突变,或在储存过程中可能会品质下降。

孵育的液体培养液应来自于健康、分离效果良好的菌落,此类菌落采集自新鲜划线的筛选平板。这一处理可确保培养液内生长的细胞均出自单个基细胞(founder cell),具有相同的遗传组成。

小贴士:体积>10 ml的培养液不可直接自平板孵育,而是应该由2–5 ml的预培养液稀释1/500到1/1000而得。

质粒规格

根据质粒所含的,决定着控制条件严格还是宽松的复制原,质粒在拷贝数方面存在很大的差异(参见下表),同时质粒的大小和相关的插入也存在很大的差异。部分质粒,如pUC系列和衍生物,含有可导致自身在细菌细胞内具有极高的拷贝数的突变。基于pBR322的质粒和很多柯斯质粒通常能够维持在较低的拷贝数。而体积极大的质粒,在每个细胞内通常都维持极低的拷贝数。

不同质粒和科斯质粒的复制起点和拷贝数
DNA结构 复制起点 拷贝数 分类
质粒
pUC载体 pMB1* 500–700 高拷贝
pBluescript载体 ColE1 300–500 高拷贝
pGEM载体 pMB1* 300–400 高拷贝
pTZ载体 pMB1* >1000 高拷贝
pBR322 and derivatives pMB1* 15–20 低拷贝
pQE载体 ColE1 ~30 低拷贝
pREP4 P15A ~30 低拷贝
pACYC and derivatives P15A 10–12 低拷贝
pSC101 and derivatives pSC101 ~5 很低拷贝
科斯质粒
SuperCos pMB1* 10–20 低拷贝
pWE15 ColE1 10–20 低拷贝
* pMB1复制原与ColE1的复制原存在极其紧密的关系,具有相同的不相容群。此处所列的高拷贝数质粒含有此复制原的突变型号。

细菌培养基和抗生素

液体培养基

大肠杆菌(E. coli)的液态培养液通常可在LB (Luria-Bertani)培养基中生长。但请注意,通常使用的LB培养基有很多种,成分也存在差异。不同的配方含有不同的NaCl浓度,可导致不同的质粒DNA产量。为获得最高的质粒DNA产量,我们建议使用表LB培养基中LB组分。

LB培养基
成分 每升含量
胰蛋白胨 10 g
酵母提取物 5 g
NaCl 10 g

如需配制1升LB培养基,需向950 ml蒸馏水或去离子水中添加10 g NaCl、10 g 胰蛋白胨以及5 g酵母粉,然后振荡、搅拌至完全溶解。用5 M NaOH将pH调整至7.0。用蒸馏水或去离子水调配溶液体积至1升。等分成小份并高压灭菌。

小贴士:为避免整个批次集体受到污染,建议在多个小瓶内对液态培养基灭菌,不要在较大的容器内集中灭菌。高压灭菌后,请勿在24小时内使用培养基,以确保其已正确灭菌,不含污染微生物。

小贴士:从已经过过滤除菌、等分成小份并在–20°C黑暗条件下储存的抗生素原液中取出的抗生素,应在使用前立即加入到液态培养基中。

培养基灭菌

依照培养基类型、培养基瓶子尺寸和高压灭菌类型适宜的压力和灭菌时间,对液态或固态培养基灭菌。

小贴士:为避免培养基在高温下沸腾,在高压灭菌前,应在瓶子中注入3/4体积的培养基,同时保持瓶盖松动。一旦培养基冷却(降至40°C以下),立即拧紧瓶盖,让其彻底灭菌。

小贴士:抗生素和氨基酸等营养物质将在高压灭菌器的高温下灭活。它们应通过孔隙为0.2 µm的过滤装置过滤灭菌,之后再添加到从妥善储存的原液中取出后的已冷却、高压灭菌的培养基中。

固体培养基

E. coli 通常在含有1.5%琼脂糖和适当抗生素的LB平板上划线和储存。

制备:依照液态培养基部分给定的组分配制LB培养基。在临高压灭菌前,每升中加入15 g琼脂糖并搅拌混合。高压灭菌之后,轻轻地涡旋培养基,以便将融化的琼脂糖均匀地分散到溶液中。应特别小心高温液体在涡旋时出现沸腾。

小贴士:将高压灭菌的琼脂糖培养基冷却到50°C以下(手握时感到温度适宜),然后再添加对温度敏感的抗生素和营养物质。在倾倒前彻底混合,以使整个培养基具有均匀的浓度。

小贴士:在层流罩内倾倒平板,如果无层流罩,则可在临近本生灯的清洁试验台面上进行倾倒。每个标准90 mm细菌培养皿中使用30–35 ml培养基(每升培养基大约对应于30个平板)。

倾倒过平板后,通过使用本生灯火焰在表面快速略过,去除气泡。切勿让火焰在某处逗留,否则可能造成平板切片内的抗生素遭破坏。

在凝固之后或者临使用之前,取下帽盖并将平板立在层流罩内1小时,直接干燥平板。此外,如果您手上没有层流罩,则可轻微开启平板盖,于37°C下在培养箱中干燥平板30分钟,或盖上盖子在室温下倒置放置2–3天。

小贴士:为保持对光线明暗的抗生素的活性,可将平板倒置,在4°C黑暗条件下储存,或者将平板卷在铝箔纸中。存储时间请勿超过3个月,因为这会造成抗生素降解。

抗生素

对于具有抗生素筛选标记的质粒或基因,携带这些质粒或基因的细菌株系应在含有筛选剂的液态或固态培养基中培养。缺少抗生素筛选剂,会造成带有遗传标记的质粒丢失,并可能筛选出快速生长的突变!

小贴士:通过经过过滤灭菌的各批次液态或固态培养基分别制备抗生素原液,均分并在–20°C黑暗条件下储存。常用抗生素建议的储存和工作浓度如下表所示。

小贴士:在刚刚高压灭菌的培养基中添加抗生素之前,请确保培养基已冷却到50°C以下。

常用抗生素的浓度
抗生素 储存溶液浓度
储存温度 工作溶液浓度(稀释)
Ampicillin (sodium salt) 水中50 mg/ml –20°C 100 µg/ml (1/500)
Chloramphenicol 乙醇中30 mg/ml –20°C 170 µg/ml (1/200)
Kanamycin 水中10 mg/ml –20°C 50 µg/ml (1/200)
Streptomycin 水中50 mg/ml –20°C 50 µg/ml (1/200)
Tetracycline HCl 乙醇中5 mg/ml –20°C 50 µg/ml (1/100)

裂解细菌细胞以进行质粒纯化

由于DNA产量和质量取决于用于纯化的细胞裂解产物质量,在质粒分离过程中,高效裂解细菌细胞是非常重要的一个步骤。

碱裂解

碱裂解是质粒纯化之前(4, 5)最常用的细菌细胞裂解方法。碱裂解过程涉及四个基本步骤。

  1. 在含有RNase A酶的Tris•Cl–EDTA缓冲液中重悬采集的细菌细胞。 
    小贴士:为确保有最大数量的细胞暴露在裂解试剂下,请确保重悬充分,无细胞抱团。 
    小贴士:如需大规模纯化低拷贝数质粒(需要使用较大体积的培养液),则为了提高碱裂解效率进而提升DNA产量,适当增大裂解液的体积较为有益。
  2. 使用NaOH/SDS裂解细胞。十二烷基硫酸钠(SDS)可使细胞膜的磷脂和蛋白质成分溶解,从而使细胞成分裂解并释放。NaOH可以灭活染色体和质粒DNA,以及蛋白质。RNase A酶的存在,则可确保裂解过程中,解离的胞内RNA能够得以消化。 
    小贴士:如果在添加了裂解液(NaOH/SDS)之后,溶液变得非常粘稠、难以搅拌,则表示溶解步骤中存在过多的生物量。这会造成细胞裂解不充分,建议将所用的裂解液和中和液量加倍。 
    小贴士:注意避免剧烈地搅动或涡旋振荡裂解液,因为这会对细菌染色体造成剪切作用,进而与质粒DNA共纯化。应轻轻地,而非将裂解试管倒置的方式搅动溶液,反复4–6次。 
    小贴士:请勿让裂解液处理的时间超过5分钟。这样做既能确保质粒DNA得到最好的释放,同时又能避免不可逆的质粒降解。
  3. 通过添加醋酸钾中和裂解液。注:高盐度会造成十二烷基硫酸钾(KDS)沉淀,且变性的蛋白质、染色体DNA和细胞细胞碎片共沉淀在不溶的盐洗涤剂复合物中。质粒DNA(环状和共价闭合形式)正确复性,并保留在溶液中。 
    小贴士:通过使用冷冻的中和液和在冰上孵育,可增强沉淀效果。
  4. 通过离心或过滤方法,清洗裂解产物,沉淀出残渣。 
    注:传统的做法是,来自于清洗后的细菌裂解液的质粒DNA的纯化,采用氯化铯(CsCl)超纯法进行纯化。目前,市面上销售有大量的商业质粒纯化试剂盒,可藉此完成各种通量要求和应用需要的纯化操作。
其它裂解方法

我们介绍了大量细菌细胞裂解的其它方法(1, 6)。其中的部分方法是针对其他应用开发的,并不适用于质粒DNA制备。

  • 煮沸裂解法:细菌细胞采用溶酶体来处理,以弱化细胞壁,然后通过在沸水中水浴约1分钟加热裂解细胞。
  • 去污剂裂解:细菌细胞通过离子去污剂(例如,SDS)或非离子去污剂(例如,Triton X-100)处理的方式进行裂解。
  • 机械裂解:细菌细胞通过机械式破碎作用裂解(例如,通过超声波处理)。 
  • 酶促消化:有些裂解方法包括了采用酶(用于帮助弱化细胞壁)进行的细菌处理步骤。 
大肠杆菌(E. coli)之外的细菌的裂解

从大肠杆菌(E. coli)之外的细菌中分离质粒DNA时,为优化特定种属的裂解条件,通常需要修改裂解步骤。

DNA的转化

制备感受态E. coli

具有(从各类来源)回收DNA能力的细胞被称为“感受态”细胞。现有多项技术可制备感受态细胞,其中的的一项制备感受态大肠杆菌(E. coli)的技术如下。

注:采用这一实验方案制备的细胞不宜用作电穿孔实验。

所需材料

  • 储存在甘油原液瓶中的E. coli
  • LB培养基
  • LB琼脂糖平板
  • 适当的筛选抗生素
  • TFB1缓冲液(参见表Buffer TFB1)
  • TFB2缓冲液(参见表Buffer TFB2)

 

Buffer TFB1
工作溶液 pH 5.8 成分 每升的量
100 mM RbCl RbCl 12.1 g
50 mM MnCl2 MnCl4H2O 9.9 g
30 mM potassium acetate Potassium acetate 2.9 g
10 mM CaCl2 CaCl2 1.1 g
15% glycerol Glycerol 15 ml
pH值调节至5.5,过滤灭菌。
 
Buffer TFB2
工作溶液 pH 6.8 成分 每升的量
100 mM MOPS MOPS 2.1 g
50 mM RbCl RbCl 1.2 g
75 mM CaCl2 CaCl2 8.3 g
15% glycerol Glycerol 15 ml
pH值调节至6.5,过滤灭菌。

 

  1. 通过一根灭菌的牙签或接种环从甘油原液瓶中取出痕量的大肠杆菌(E. coli)细胞,将其接种到含有适当浓度的相关筛选抗生素的LB琼脂糖平板上。如果宿主株系已经过培养并储存在2–8°C下(在保证活性和存活力无大幅下降的前提下,培养物最多2–8°C条件下储存3个月),则请从此类原液中挑出细菌。
  2. 在37°C下孵育过夜。
  3. 取一种菌落,接种到含有相关抗生素的10 ml LB培养基中。在37°C下生长过夜。
  4. 将1 ml过夜的培养物添加到100 ml含有相关抗生素的预热LB培养基中,然后放入500 ml摇瓶中,在37°C条件下振荡,直至OD600达到0.5(约需要90–120分钟)。
  5. 在冰上冷却培养物5分钟,然后将培养物转移到无菌、圆底的离心管中。
  6. 低速离心收集细胞(时长5分钟,速度4000 x g,温度4°C)。
  7. 小心地吸弃上清液。将细胞一直置于冰上。
  8. 在冰冷的(4°C) TFB1缓冲液(30 ml,适于100 ml培养物)中轻轻地重悬细胞,然后将悬液在冰上再置于冰上90分钟。
  9. 离心收集细胞(时长5分钟,速度4000 x g,温度4°C)。 
  10. 小心地吸弃上清液。将细胞一直置于冰上。
  11. 在4 ml冰冷的TFB2缓冲液中小心地重悬细胞。
  12. 在无菌的微量离心管中制备成100–200 µl等份,在液氮或干冰-酒精混合液中冷冻。在–70°C下储存感受态细胞。

转化感受态E. coli

转化是将质粒DNA引入细菌宿主细胞的过程。有多种方法可供转化细菌细胞,其中的一种方法如下。

  • 感受态大肠杆菌(E. coli)细胞 
  • SOC培养基
  • LB琼脂糖平板
SOC培养基
成分 每升的含量
胰蛋白胨 20 g
酵母提取物 5 g
NaCl 0.5 g
Dissolve, then add:
250 mM KCl 10 ml
2 M MgCl2 5 ml
Autoclave, cool, then add:
1 M sterile glucose 20 ml
未通过高压灭菌消毒,溶液通过0.2 µm过滤。
  1. 将一份准备转染的等份DNA(10 µl或更少)转移到冰冷、灭菌的1.5 ml微量离心管中,将其置于冰上。
  2. 解冻放在冰上的一等份冰冻的感受态大肠杆菌(E. coli)细胞。 
  3. 轻轻地重悬细胞,然后转移100 µl细胞悬液到含有质粒DNA的微量离心管中,小心地混合,然后置于冰上约20分钟。
  4. 将离心管移到42°C水浴或恒温槽中放置90秒。 
  5. 向细胞中添加500 µl SOC培养基,在37°C下孵育60–90分钟。 
    小贴士:振荡可提升转化效率。
  6. 在含有相关抗生素的LB琼脂糖平板中铺盘成50、100和200 µl等份。在37°C下过夜孵育平板,直至菌落生长成型。 
阳性对照检查转化效率

采用1 ng含有抗抗生素基因的参比基因转化感受态细胞。铺盘到含有相关抗生素的LB琼脂糖平板上。比较采用对照质粒获得的菌落数量和采用感兴趣的质粒获得的菌落数量,进而比较转化效率。

阴性对照检查抗生素活性

在含有相关抗生素的单个LB琼脂糖平板中铺盘至少200 µl的转化混合物。平板上没有菌落则表示抗生素具有活性。

异丙醇沉淀DNA

乙醇沉淀法是常用的核酸浓缩、脱盐和恢复方法。沉淀由高浓度的盐和附加的异丙醇或乙醇成分介导。异丙醇沉淀法所需的乙醇量较少,因而成为了大批量DNA沉淀的首先方法。此外,异丙醇沉淀法可在室温下进行,可最大限度减少感染下游应用的盐共沉淀现象。

  1. 采用醋酸钠(0.3 M,pH 5.2,终浓度)或醋酸铵(2.0–2.5 M,终浓度)等,视必要调节盐浓度。
  2. 向DNA溶液中添加0.6–0.7体积的室温异丙醇,然后充分混合。
    小贴士:请在室温下使用所有溶液,以便最大限度减少盐共沉淀现象。 
    小贴士:请勿使用聚碳酸酯试管进行沉淀,因为聚碳酸酯无耐异丙醇腐蚀能力。
  3. 立即在4°C下以10,000–15,000 x g的速度离心样本15–30分钟。 
    小贴士:应在4°C下离心,以防止样本过热。(小量沉淀时,可在室温下离心。) 
    小贴士:也可在添加异丙醇后,使用玻璃棒,通过DNA螺旋化沉淀基因组DNA。螺旋化的DNA应立即转移到含有适当的缓冲液微量离心管中,然后再溶解(参见步骤9)。 
  4. 在不破碎沉淀的前提下,小心地倒出上清液。  
    小贴士:在离心之前在试管外侧做出标记,可更轻松地确定不同的沉淀。异丙醇沉淀法的沉淀具有玻璃光泽外观,相对于通过乙醇沉淀法获得的蓬松的含盐沉淀,更难以看到。
    小贴士:去除上清液时需小心处理,这是因为异丙醇沉淀法获得的沉淀会更疏松地粘附在试管一侧。 
    小贴士:使沉淀处于上方,小心地倾倒试管,以免沉淀移动。
    小贴士:对于较为珍贵的样本,可保留上清液,直至已验证过沉淀DNA的恢复。 
  5. 添加1–10 ml(具体取决于制备规格)室温的70%乙醇,洗涤DNA沉淀。此步骤可去除共沉淀盐,并用更具挥发性的乙醇代替异丙醇,让DNA更易溶解。 
  6. 在4°C下,以10,000–15,000 x g的速度下离心5–15分钟。 
    小贴士:按照与之前的处理相同的方向离心试管,以便将DNA回收成紧凑的沉淀小球。
  7. 在不破碎沉淀的前提下,小心地倒出上清液。  
  8. 风干沉淀5–20分钟(具体取决于沉淀的尺寸)。 
    小贴士:请勿过度风干沉淀(例如使用真空蒸发器),因为这会造成DNA,尤其是高分子DNA难以溶解。
  9. 在适宜的缓冲液中重新溶解DNA。  
    小贴士:根据预期的DNA产量和所需的最终DNA浓度,选择适当体积的缓冲液。  
    小贴士:请使用pH为7.5–8.0的缓冲液,因为DNA不易在酸性缓冲液中溶解。(如采用水,则请核实其pH值。) 
    小贴士:请冲洗试管壁以回收全部的DNA,尤其是在使用玻璃试管时。为避免DNA剪切作用,请勿移液或涡旋。 
    小贴士:为避免出现剪切作用,应非常温和地再溶解高分子DNA(如基因组DNA),例如室温下过夜,或者55°C下轻轻搅动溶解1–2小时。

储存DNA

纯化的DNA应在–20°C或–70°C下,在弱碱性环境(例如,pH 8.0的Tris?Cl或者TE缓冲液;参见表 1 mM Tris·Cl和TE缓冲液),因为酸性条件可造成DNA水解。请勿反复冻融,因为这会造成DNA沉淀。

稀释后的核酸溶液(例如,用作标准品的倍比稀释系列)应分成等份储存(如有可能,请储存在硅胶管中),并仅融解一次。这种处理可避免核酸吸附在试管壁上,从而造成溶液中的核酸浓度下降。

1 mM Tris·Cl
成分 每升的量
Tris base 121.1 g
用HCl调节pH值。

 

TE缓冲液
成分 每升的量
1 M Tris·Cl, pH 7.4 10 ml
0.5 M EDTA, pH 8.0 2 ml

内毒素及其注意事项

何为内毒素?

内毒素又名lipopolysaccharides或LPS,是革兰氏阴性细菌(例如,大肠杆菌(E. coli))的细胞膜成分。细胞膜外膜的外层脂质部分全部由内毒素分子组成。一个大肠杆菌(E. coli)细胞约含有2百万个LPS分子,而每个LPS分子又包含一个疏水脂质A部分、一个糖残基复合物阵列,以及一个带负电的磷酸盐基团。因此,每个内毒素分子处理疏水、亲水和带电的区域,使其具备了与其他分子相互作用的独特功能。细菌积极生长过程中会向周围的环境排出少量的内毒素,而在其死亡时则会一次性释放大量内毒素。为制备质粒而裂解细菌细胞时,内毒素分子从细胞外膜释放到裂解液中。

内毒素能够大幅降低内毒素敏感细胞系的转染效率。此外,在转染试验中,内毒素还会和DNA竞争“游离”的转染试剂,影响质粒DNA的回收。总而言之,内毒素代表了转染试验设计中的一种不可控变量。它们在琼脂糖凝胶中不可见,无法通过光密度法检测出来,且会影响试验结果和结果的可重现性,使您难以对结果进行比对和解释。

不同质粒制备方法的内毒素污染

内毒素分子的化学结构和性质,以及其易于形成胶束的趋向,都使其可以与质粒DNA共纯化。例如,在CsCl超速离心法中,CsCl分带的DNA易受内毒素分子污染,在CsCl中,内毒素分子具有与质粒-溴化乙锭复合物类似的密度。

在尺寸排阻树脂中,内毒素组成的胶束尺寸较大,会使内毒素分子的行为表现类似于DNA大分子,在阴离子交换色谱柱中,内毒素上存在的负电荷可与阴离子交换树脂相互作用,导致内毒素和质粒DNA共纯化。

即便如此,质粒DNA中存在的内毒素污染水平仍然依赖于所选用的纯化方法。

如何测定内毒素?

传统的做法是,通过内毒素和海鲎(Limulus polyphemus)的阿米巴样细胞凝固蛋白之间的凝聚反应来测定内毒素。

如今则采用灵敏度高得多的光度测定法(例如,BioWhittaker, Inc.的Kinetic-QCL测定),该法基于鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)和合成生色底物。LPS污染程度通常以内毒素单位(EU)来表示。通常情况下,1 ng LPS对应于1–10 EU。

内毒素对生物应用的影响

内毒素会大幅影响DNA转染进原代细胞核敏感培养的细胞,较高的内毒素水平还会显著降低沾染效率。此外,在基因疗法应用中采用不含内毒素的质粒DNA也非常重要,这是因为内毒素会引起动物和人发烧、内毒素休克综合征、以及补体级联激活等临床症状。

内毒素还会通过免疫反应非特异性激活,干扰体外转染进哺乳动物细胞(例如巨噬细胞和B细胞)。此类反应包括免疫介导物(例如,IL-1和前列腺素)的诱导合成。为避免误读实验结果,确保塑料器皿、培养基、血清和质粒DNA不含LPS污染物非常重要。

不含内毒素的塑料和玻璃器皿

为避免在初次内毒素去除之后质粒DNA被二度污染,建议仅使用经认证不含致热源、不含内毒素的新塑料制品。不含内毒素、不含致热源的塑料制品可自很多供应商处购买。

内毒素对玻璃制品具有较强的吸附性,在洗涤时难以彻底清除。标准的实验室高压灭菌操作对内毒素水平无影响或者影响很小。此外,如果之前已采用高压灭菌设备处理过细菌,玻璃制品会受到内毒素分子过渡污染。为彻底杀灭粘附的内毒素分子,建议在180°C下过夜加热玻璃制品。

此外,使用不含内毒素的试剂,避免纯化的不含内毒素DNA不受二度污染非常重要。

定量DNA

对于很多分子生物学应用,可靠测定DNA浓度非常重要。分光光度测定法和荧光测定法是常用的基因组和质粒DNA浓度测定方法。分光光度测定法可用于测定微克量级的纯DNA样本(即,不受蛋白质、苯酚、琼脂糖或RNA污染的DNA)。荧光测定法更敏感,可测定纳克量级的DNA,此外使用Hoechst 33258染料可以对DNA进行特异性分析。

分光光度测定法

可通过在石英分光比色液槽中,用分光光度计测定260 nm (A260)下的吸光度来测定DNA浓度。为确保最高的精度,读数应处于0.1和1.0之间。260 nm处1单位的吸光度,对应于每ml内50 µg基因组DNA(A260 =1对应于50 µg/ml;基于标准的1 cm通道长度。这一关系仅在中性PH下测定时有效,因此样品应采用中性PH的低盐缓冲液(例如,pH 7.0的Tris•Cl)稀释。

处理少量DNA时,诸如使用纯化后的PCR产物或提取自琼脂糖凝胶的DNA片段,通过琼脂糖凝胶分析定量将更有效。

小贴士:如果您使用多个比色皿测定多个样本,所用的各个比色皿必须相匹配。

小贴士:分光光度法测定并不区分DNA和RNA,因此RNA污染物会造成估算出的DNA浓度虚高。

小贴士:苯酚具有最高270–275 nm的吸光范围,与DNA的吸光范围比较接近。苯酚污染物会造成虚假的高产量和高纯度,这是因为A260值出现上调。

溶剂对分光光度计读数的影响

核酸的吸光度取决于溶解核酸所用的溶剂(7)。使用低盐度缓冲液时,A260数值可重现,但如果使用水,则不可实现。由于空气中CO2溶解而引起的水PH值变化时,很可能出现这种情况。在水中测定的A260/A280比率也会引起读数(参见溶剂对A260/A280比率的影响)出现较大波动,通常获得的比率<1.8,这会造成对蛋白污染物的敏感度下降(7)。相反,在低盐、弱碱性PH值的缓冲液下测得的A260/A280比率通常是可重现的。

RNA污染对分光光度读数的影响

根据所使用的DNA分离方法,RNA将与基因组DNA共同纯化。RNA可能会抑制一些下游的应用,但它不会抑制PCR。分光光度法测量不能分辨DNA和RNA,所以RNA的污染可导致DNA浓度被高估。虽然不能被有效地定量检测,RNA污染有时仍可以通过琼脂糖凝胶电泳分析配合常规溴化乙锭染色进行检测。RNA条带出现模糊和污染,并且只在≥25-30 ng可以被检测到(RNA:DNA的比例为0.5:1 )。

RNase A处理将去除被污染的RNA,这可以合并到纯化步骤中或在DNA被纯化后进行。在使用之前,为了破坏任何可能存在的DNase活性污染,请确保RNase A的溶液已经被热处理过。或者,使用从一个可靠的供应商处购买的去DNase的RNase。

质粒DNA的RNA污染取决于质粒的制备方法。使用碱裂解与苯酚抽提的方法不能从质粒DNA中分离出RNA,从而导致高水平的RNA污染。先进的阴离子交换技术可以分离高分子量的不含RNA的基因组DNA。

DNA的纯度

在260 nm和280 nm处的读数比值(A260/A280)提供了相对于吸收紫外光污染物(如蛋白质)的DNA纯度估计值。A260/A280比值受pH值影响显著。由于没有缓冲作用,pH值和由此产生的A260/A280比值可以变化很大。较低的pH值会导致较低的A260/A280比值,同时降低对蛋白质污染的敏感性(7)。为获得精确的A260/A280值,我们建议在微碱性缓冲液中测量吸光度(如10 mM Tris•Cl, pH 7.5)。一定要使用适当的缓冲液对分光光度计较零。

纯DNA A260/A280比值为1.7–1.9。在220–320 nm之间扫描吸光度,将显示在260 nm处是否有污染物影响吸光度。吸光度扫描曲线应该在260 nm出现峰值并且整体平滑。

荧光分析法

荧光分析法通过使用荧光染料可以对DNA浓度进行特异性、灵敏的测定,其可采用包括Hoechst染料和PicoGreen在内的常见染料。

Hoechst3258对RNA的亲和力较小,可以精确定量被RNA污染的DNA样品。这表明与DNA结合后在458 nm荧光值增加。DNA标准品和样品与Hoechst33258混合,使用扫描型荧光分光光度计或专用滤波器荧光计在365 nm激发波长和460 nm发射波长在玻璃或丙烯酸比色皿中测定。样品测量结果与标准品进行比较,以确定DNA浓度。

小贴士:因为Hoechst33258优先与AT富集的DNA结合,请使用与DNA样品具有类似碱基组成的标准品。

PicoGreen测定法对dsDNA高度敏感,可以在200 µl体积中测量低至20 pg的dsDNA。其实,从500 pg/ml到500 ng/ml浓度的DNA都可以使用单一浓度的染料测定。该测定已经过优化,可最大限度减少RNA和ssDNA的荧光值,使得dsDNA可以在等摩尔浓度的ssDNA和RNA存在的情况下精确定量,并最大限度减少二者定量结果的影响。

琼脂糖凝胶

琼脂糖凝胶电泳分析能够快速而简单地定量检测DNA,特别是小DNA片段(如PCR产物)。少至20 ng的DNA都可通过琼脂糖凝胶电泳配合溴化乙锭染色进行检测。在琼脂糖凝胶上,DNA样品是在已知量的相同或类似大小DNA的旁边进行电泳。加样的样品DNA的量可通过可视化或成像系统扫描其条带强度与标准品的对比来估计。标准品的片段大小请务必与目的基因大致相同,以确保DNA含量评估的可靠性,因为较大片段比小片段更易螯合染料,形成更强的条带强度。

更精确的琼脂糖凝胶定量可以通过密度计分辨条带强度,并与使用已知浓度的DNA所产生的标准曲线进行比较。大多数实验中的有效密度定量范围在20–100 ng之间。

小贴士:用于密度定量的DNA量应落在标准曲线的线性范围内。

有关琼脂糖凝胶电泳更多的信息请见使用凝胶分析DNA 。

DNA的限制性内切酶消化

限制性内切酶消化原理

许多应用都需要使用限制性内切酶将gDNA转换为大小适宜的片段。这一处理可获得大小适宜、利于下游操作的DNA片段。限制性内切酶是一种可以在特异性靶序列内结合和剪切DNA的细菌酶。II型限制性内切酶是分子生物学中最广泛使用的工具。它们在特异性识别位点结合DNA,其中包括一个短回文序列,并且在该位点内裂解,例如,AGCT(用于AluI)中,GAATTC( 用于EcoRI)等。同裂酶是一种不同的酶,他们具有相同的特异性,并在某些情况下还具有相同的剪切类型。

小贴士:同裂酶属性可能略有不同,这点非常有用。例如,MboI和Sau3A酶具有相同的序列特异性,但MboI不剪切甲基化DNA,而Sau3A可以。因此,在需要的时候,Sau3A可以用来代替MboI。

选择合适的限制性内切酶

选择合适的限制性内切酶时需要考虑以下几个因素:

  • 片段大小
  • 甲基化敏感性
  • 平端/粘性末端片段
  • 反应条件的相容性(使用一个以上的酶时)
片段大小

限制性内切酶具有较短的识别序列并且比那些具有较长识别序列的酶剪切的更为频繁。例如,一个4碱基对(bp)的剪切酶平均剪切44(256)个碱基,而一个6 bp的剪切酶平均剪切46(4096)个碱基。

小贴士:定位基因组DNA或YAC、BAC或者P1可使用6 bp剪切酶,因为这些酶剪切片段的大小范围适合于克隆。

甲基化

许多有机体具有一种被称为甲基化酶的酶,可以在特定序列将DNA甲基化。当位点被甲基化后,不是所有的限制性内切酶都能剪切其识别的位点。因此,限制性内切酶的选择受其对甲基化敏感性的影响。此外,甲基化模式在不同的物种间具有差异,这也影响到限制性内切酶的选择。

  • 与概率预期相比,CpG二核苷酸在哺乳动物DNA中发生甲基化大约减少5倍量,如果胞嘧啶被甲基化,则大多数限制性内切酶在CpG二核苷酸识别位点无法剪切。因此,许多酶在CpG的识别位点,如 EagI、NotI和SalI很少剪切哺乳动物DNA。
  • 果蝇、线虫和其它一些物种不具有甲基化的DNA,并其CpG二核苷酸的含量比例高于哺乳动物。因此Rare剪切酶在这些物种中的剪切更加频繁。
  • 植物的DNA是高度甲基化的,所以为了在植物中成功定位,所选择的酶要么在其识别位点不含有CpG二核苷酸(例如DraI或SspI),要么可以剪切甲基化的CpG二核苷酸(例如,BamHI、KpnI或者TaqI)。

小贴士:细菌和真核生物之间的甲基化类型不同,所以克隆和非克隆DNA的限制带型可能会有所不同。

小贴士:不同真核生物之间的甲基化类型也不同(见以上图表),并影响构建基因组DNA文库的限制性内切酶的选择。

平端/粘性末端片段

有些限制性内切酶剪切识别位点的中段,产生平端的DNA片段。然而,大多数酶的剪切交错在每条链上,导致在每个片段的末端出现含有数个碱基对的单链DNA,被称为“粘性”末端。有些酶剪切出5'突出端而其他一些则剪切出3'突出端。剪切的类型会影响下游克隆的难易:

  • 粘性末端片段可以轻易连接到具有单链突出端的其他片段的粘性末端,从而产生高效的克隆。
  • 平末端片段的连接效率通常要少得多,使得其克隆更加困难。然而,任何平端片段可以与任何其他的平端相连接,所以当不能生成亲和的粘性末端片段时,就要使用平端剪切酶,例如,如果载体的多接头位点不含有被克隆片段的酶亲和位点。
反应条件的相容性

如果使用一种以上的酶对DNA片段进行剪切,这两种酶可以同时添加到反应中,前提是它们在相同的缓冲液中活性相同并可在同一温度下进行反应。如果酶不具有亲和的反应条件,有必要对反应产物进行剪切、纯化,然后进行第二次剪切。

限制性剪切成分
  • DNA
  • 缓冲液

剪切的DNA量依赖于下游应用和被分析生物的基因组大小。我们建议哺乳动物和植物基因组DNA蛋白印迹法每次反应使用至少10 µg的DNA。为了定位克隆DNA,每个反应0.2–1 µg DNA足够。

小贴士: DNA应无苯酚、氯仿、乙醇,洗涤剂或盐等污染,因为这些污染物可能对限制性内切酶活性造成干扰。

一单位的限制性内切酶在1小时内可以完全剪切1 µg底物DNA。然而,超螺旋质粒DNA通常需要超过1个单位/µg的酶才能被完全剪切。为了确保完全剪切,大多数研究人员加入10倍过量的限制酶确保完全反应。

小贴士:请确保限制性内切酶不超过总反应体积的10%,否则承载酶的甘油可能会抑制剪切。

反应体积

大多数剪切是在10–50 µl的体积中进行。(反应体积小于10 µl易受移液误差影响,不推荐使用。)

限制性酶切准备

  1. 将反应组分移液到皮氏管中并用移液枪拌匀。
    小贴士:彻底混合非常重要。
    小贴士:酶应保持在冰上并在最后添加。
    小贴士:当准备大量的剪切反应,用缓冲液和酶配制反应预混液,并等分到含有被剪切DNA的皮氏管中。
  2. 短暂离心后收集底部的液体。
  3. 使用水浴或加热模块在37℃孵育剪切反应,通常需要1-4小时。然而一些限制性内切酶需要更高的孵育温度(如50–65℃),而其他则要求较低的(如25℃)孵育温度。
  4. 对于一些下游应用,有必要在剪切反应后热灭活酶。剪切反应后加热至65℃保持20分钟,灭活大多数最佳孵育温度为37℃的酶。注意,某些限制性内切酶并不能完全被热处理灭活。

DNA的连接

为了构建新的DNA分子,DNA必须先使用限制性内切酶剪切(参见 DNA的限制性内切酶剪切)。所需DNA分子的各个组分被纯化,然后合并,用DNA连接酶处理。连接混合物被导入到感受态大肠杆菌细胞中,转化效果通过适当的遗传选择鉴别。同时也应适当的连接对照反应进行

从线性化载体DNA去除 5'磷酸可以帮助防止载体的自身连接,提高连接效率。从DNA除去5'磷酸,添加小牛肠磷酸(CIP)缓冲液和1 U CIP在 37℃孵育30–60分钟。一旦反应完成后,通过加热至75℃15分钟灭活CIP。

  1. 按照表典型连接反应建立典型的连接反应。
  2. 2. 15℃下孵育1-24小时。
    小贴士:简单的两片段4 bp的3’或5’突出端连接反应比更复杂的连接反应或平端连接反应所需要的酶要少得多。DNA的质量也将影响所需连接酶的量。
    小贴士:粘性末端的连接通常是在12–15℃下进行,目的是在末端退火和酶活性保持之间找到平衡。较高的温度下末端退火比较苦难,而较低的温度会降低连接酶的活性。
    小贴士:平端连接反应通常在室温下进行,因为退火不是一个影响因素,但这种酶在高于30℃是不稳定的。相比达到同等效率的粘性末端连接反应,平端连接反应需要大约10–100倍以上的酶。
  3. 介导1–10 µl的连接产物到感受态大肠杆菌细胞中,并使用存在于载体上的遗传标记选择转化株
  4. 通过小量制备过程从单个 E. coli转化株纯化质粒或噬菌体DNA,并通过限制酶定位确定它们的结构。
    小贴士:建议在每一次转化实验中加入两个对照:一个没有DNA的“模拟”转化组,以及一个已知量的闭合环状质粒DNA转化组。

 

典型的连接反应
成分
感受态DNAs 0.1–5 µg
连接酶缓冲液 多种
10 mM ATP 1 µl
T4 DNA连接酶 20–500 U

如果实验出错,则对照组是必不可少的。例如,模拟转化的细菌平板菌落可以显示该培养基是否缺乏正确的抗生素。未构建质粒的细菌转化组平板上没有出现菌落只有使用标准DNA的阳性对照组才能解释。

使用分析凝胶分析DNA

凝胶可以基于电荷迁移原理分离和鉴定核酸。核酸分子在电场中的迁移是由大小和构象决定的,从而使得不同大小的核酸片段得以分离。然而,片段的大小和迁移率之间的关系是非线性的,因为较大的片段具有更大的摩擦阻力,并且在聚合物中迁移效率更低。

琼脂糖凝胶分析是0.1至25 kb 长度DNA片段最常用的分析方法,而脉冲场凝胶电泳可分析的DNA片段达到10,000 kb。本节提供了DNA凝胶分析有益的建议。

倒琼脂糖凝胶

琼脂糖浓度

用于凝胶的琼脂糖的浓度主要取决于进行分析的DNA片段大小。低浓度琼脂糖被用于分离大片段DNA,而高浓度的琼脂糖可以提高小DNA片段的分辨率。虽然一些特殊类型的琼脂糖可用于特定的应用,但大多数凝胶使用的是标准琼脂糖。例如,低熔琼脂糖上可以进行原位酶促反应,因此可用于制备凝胶。基因组DNA可以直接从固定细胞的低熔点琼脂糖凝胶中分离出来。

小贴士:使用超纯琼脂糖可以避免多糖、盐和蛋白质等杂质对DNA迁移的影响。使用高百分比琼脂糖凝胶琼脂糖时,质量就显得尤为重要。

用于分离不同大小片段的琼脂糖浓度
琼脂糖浓度 (% w/v) DNA片段大小范围(kb)
0.3* 5–60
0.5 1–30
0.7 0.8–12
1.0 0.5–10
1.2 0.4–7
1.5 0.2–3
2.0* 0.1–2
来自参考文献1和6.
*虽然一些特殊类型的琼脂糖可用于特定的应用以及非常高或低的琼脂糖浓度,但大多数凝胶使用的是标准琼脂糖。例如,低熔琼脂糖上可以进行原位酶促反应,因此可用于制备凝胶。
电泳缓冲液

最常用的琼脂糖凝胶电泳缓冲液是TBE(Tris•borate–EDTA)和TAE(Tris•acetate–EDTA)。TAE虽然使用越来越频繁,但与TBE相比,TAE缓冲能力较低,并且在长时间电泳过程中更容易耗尽。TBE能提供更好的分辨率和更清晰的条带,特别推荐用于分析片段大小 <1 kb的情况。

TBE的缺点是,缓冲液中的硼酸盐离子会与糖单体和聚合物的cis-diol基团形成复合物,因此很难从使用传统方法TBE凝胶中提取DNA片段。

TAE
1x工作溶液成分 每升50x储存溶液成分 每升的量
40 mM Tris·acetate Tris base 242 g
1 mM EDTA 冰醋酸 57.1 ml
0.5 M EDTA, pH 8.0 100 ml

 

TBE
0.5x工作溶液成分 每升5x储存溶液成分 每升的量
40 mM Tris·borate Tris base 54 g
1 mM EDTA Boric acid 27.5 ml
0.5 M EDTA, pH 8.0 20 ml

 

Gel 上样缓冲液
6x工作溶液成分 每10 ml 5x储存溶液成分 每10 ml的量
0.25% bromophenol blue Bromophenol blue 25 mg
0.25% xylene cyanol FF Xylene cyanol FF 25 mg
40% (w/v) 蔗糖* 蔗糖 5 ml
* 可以用15%聚蔗糖(400型),或30%的甘油代替蔗糖。

凝胶灌注

  1. 准备足够的1X电泳缓冲液,以便灌注凝胶和填满电泳槽。
  2. 添加适量琼脂糖(取决于所需的浓度)到盛装适量电泳缓冲液的摇瓶或小瓶中(取决于正在使用的电泳装置的类型)。
    小贴士:盛装容器不应超过半满。覆盖容器以减少蒸发。
    小贴士:始终使用同一批缓冲制备用于凝胶的琼脂糖,因为离子强度的微小差别会影响DNA的迁移。
  3. 在微波炉或沸水浴中加热的浆液,间或涡旋容器直到琼脂糖溶解。
    小贴士:请确摇瓶盖是松动的,以免积聚的压力。小心勿让琼脂糖溶液因为变得过热而沸腾。
    小贴士:如果液体的体积在加热过程中因蒸发而大大减少,则需用蒸馏水弥补至原来的体积。这一处理可确保琼脂糖的浓度是正确的,并且凝胶和电泳缓冲液具有相同的缓冲组分。
  4. 将琼脂糖冷却至55–60℃。
  5. 将琼脂糖溶液倾倒入厚度为3–5 mm的凝胶电泳槽中。填充凝胶之前或在填充之后立刻插入梳子。让凝胶凝固(30–40分钟)。
    小贴士:确保梳子的底部和玻璃板(0.5–1.0 mm)之间有足够的空间,以便形成适当的梳孔,避免样品泄漏。
    小贴士:请确保凝胶内或梳孔中没有气泡。
  6. 小心从凝胶中取出梳子和胶条(如果使用)。用电泳缓冲液填充含有凝胶的电泳槽。
    小贴士:加入足够的缓冲液覆盖凝胶,凝胶到液体表面的深度大约1 mm。如果使用的缓冲液太多,电流将流过缓冲液,而不是凝胶。

进行琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳可以分析大小在0.1到25 kb范围内的DNA片段(比如,用频繁剪切的限制性核酸内切酶消化的基因组DNA),而脉冲场凝胶电泳可以分析长达10,000 kb的DNA片段(比如,未消化的基因组DNA或者用稀有剪切的限制性核酸内切酶消化的基因组DNA)。加载到凝胶上的基因组DNA的量取决于具体的应用,但通常情况下,应该避免加入太多的DNA,因为这会造成凝胶上DNA条带脱尾。

在加样之前,必须在样品中加入凝胶加样缓冲液,这主要是因为三个目的:

  • 增大样品的密度,确保在加样时,样品能下沉到小孔中。
  • 通过使用染料,比如溴酚蓝或者二甲苯蓝,使样品带有颜色,以便辅助加样。
  • 通过染料和特定大小的DNA片段的共迁移来追踪电泳过程。

在进行凝胶电泳时,一定要包含分子量标记物,以便分析样品中DNA片段的大小。常用标记物的信息请参见表琼脂糖凝胶电泳中常用的DNA标记物。

琼脂糖凝胶电泳中常用的DNA标记物
l HindIII l HindIII–EcoR1 EcoR1 f X174 HaeIII
21,130 21,226 21,226 1353
9416 5184 7421 1078
6557 4973 5804 872
4361 4268 5643 603
2322 3530 4878 310
2027 2027 3530 281
564 1904 271
125 1584 234
1375 194
947 118
831 72
564
125
样品的准备
  1. 将1体积的凝胶加样缓冲液加入到6体积的DNA样品中并混合。
    在样品加样到凝胶上之前,一定要与凝胶加样缓冲液混合。
    小贴士:样品的体积,不应接近于加样孔的体积,因为样品可能会溢出,进入相邻的加样孔。
    小贴士:确保所有样品中的缓冲液的成分是相同的。比如,一些限制性的缓冲液,具有很高的盐浓度,这会阻碍DNA片段的迁移。
    确保样品中没有乙醇,因为乙醇会导致加样时样品流出加样孔。
琼脂糖凝胶电泳
  1. 将凝胶加样缓冲液中的样品,加入到凝胶加样孔中。
    在加样之前,通过用电泳缓冲液洗涤,去除加样孔中的气泡。
    小贴士:确保整个凝胶都浸入到了电泳缓冲液中。
    小贴士:在加样时,将移液管吸头插入加样孔深处,并将液体缓缓排出。
    小贴士:注意不要用移液管吸头破坏琼脂糖凝胶。
    小贴士:加入样品之后,不要移动电泳槽,因为这样会使样品流出加样孔。
    小贴士:至少一条泳道是合适的分子量标记物。
  2. 连接电极,这样DNA分子会向阳极迁移(正电极)。
    小贴士:一定要覆盖电泳仪器,以避免受到电击。
  3. 接通电源,在1–10V/cm的条件下进行电泳,直到染料迁移了合适的距离。这取决于所要分析的DNA大小,凝胶中琼脂糖的浓度,以及所需要的分离程度。
    小贴士:避免使用高电压,这会导致凝胶中DNA条带的脱尾,特别是对于高分子量的DNA分子而言。
    小贴士:在进行电泳时,周期性的监控缓冲液的温度。如果缓冲液的温度很高,那么需要降低电压。
    小贴士:如果琼脂糖凝胶在电泳中溶解了,这说明缓冲液制备的不正确,或者缓冲液在电泳中消耗完了。
    小贴士:对于非常长时间的电泳,比如过夜的电泳,使用泵循环利用缓冲液。
脉冲场凝胶电泳
  1. 将凝胶加样缓冲液中的样品加入到凝胶加样孔中。
    小贴士:脉冲场凝胶电泳使用很高的电压,因此应该使用TBE缓冲液,它比TAE缓冲液有更强的缓冲能力。
    小贴士:在加入样品之前,通过使用电泳缓冲液洗涤,赶走加样孔中的气泡。
    小贴士:确保整个凝胶都浸入到了电泳缓冲液中。
    小贴士:在加样时,将移液管吸头插入加样孔深处,并将液体缓缓排出。注意不要用移液管吸头破坏琼脂糖凝胶。
    小贴士:加入样品之后,不要移动电泳槽,因为这样会使样品流出加样孔。
    小贴士:至少一条泳道是合适的分子量标记物。
  2. 连接电极,这样DNA分子会向阳极迁移(正电极)。
    小贴士:一定要覆盖电泳仪,以避免受到电击。
  3. 接通电源,在170V/cm的条件下进行电泳,每隔5–40s改变电压方向,直到染料迁移了合适的距离。这取决于所要分析的DNA尺寸,凝胶中琼脂糖的浓度,以及所需要的分离程度。
    小贴士:在进行电泳时,周期性的监控缓冲液的温度。如果缓冲液的温度很高,则需要降低电压。
    小贴士:如果琼脂糖凝胶在电泳中溶解了,这说明缓冲液制备的不正确,或者缓冲液在电泳中消耗完了。
    小贴士:对于非常长时间的电泳,比如过夜的电泳,请使用泵循环缓冲液。

凝胶电泳的可视化分析

染色

为了将DNA样品可视化,需要用合适的染料将琼脂糖凝胶染色。最常用的染料是嵌入式的荧光染料溴化乙锭,在电泳之前和之后加入都可以。此外,也可选择其它染料,包括一些最近开始使用的市售染料,比如SYBR Green。

小贴士:溴化乙锭原液(通常为10 mg/ml)应该储存在4°C的环境下,储存在深色瓶子或者被铝箔包裹的瓶子中。

在电泳前加入溴化乙锭——将0.5 µg/ml的溴化乙淀加入到融化并冷却的琼脂糖中,也就是在制备凝胶之前加入。

将琼脂糖-溴化乙锭溶液充分混匀,以避免局部染色。

在电泳之后加入溴化乙淀——将凝胶浸泡在0.5 µg/ml的溴化乙锭(在水溶液中或者在电泳缓冲液中)中30–40分钟。

小贴士:在检查凝胶之前,使用水或者缓冲液洗涤,以除去多余的溴化乙锭。

小贴士:染色的缓冲液可以收集起来重新使用。

注:溴化乙锭是一种效果很强的诱变剂,毒性很高。在操作时要戴手套,并且采取合适的安全措施。因为乳胶手套可能不能提供完全的保护,所以要使用丁晴手套。在使用之后,应该按照常规使用手册里面所描述的方法对溴化乙锭溶液去污。

可视化

溴化乙锭-DNA偶联物比溶液中的燃料荧光强度更强。这意味着,使用紫外光(254–366 nm)照射琼脂糖凝胶,可以在未结合DNA分子的染料背景上,显示出DNA条带。凝胶的图像可以通过波拉一步摄影技术或者凝胶成像系统记录下来。

小贴士:紫外光会伤害眼睛和皮肤。在使用紫外光源工作时,一定要佩戴合适的护目镜和面部保护器械。

小贴士:紫外光线会损害DNA。如果需要将DNA片段从凝胶里面提取出来,尽量使用低强度的紫外光源,并且尽量缩短DNA暴露在紫外光源下的时间。

溴化乙锭染色方法的比较
在电泳前加入溴化乙锭 在电泳后加入溴化乙锭
处理起来更快,并且操作更为方便 处理流程较慢,并且需要额外的步骤
在电泳时可以监控分子的迁移 在电泳时不能监控分子的迁移
需要对电泳槽和电泳梳子进行去污清洁 不需要对电泳槽和电泳梳子进行去污清洁
需要较多的溴化乙淀 需要较少的溴化乙淀
线形DNA分子的电泳迁移率降低了 ~15% 不影响电泳迁移率

使用DNA印迹法(Southern印迹)分析DNA

DNA印迹法是一种广泛使用的技术,用于分析特定的DNA序列。首先使用限制性的酶消化,将DNA分子转变成大小易于操作的片段。然后将DNA分子加入到琼脂糖凝胶中进行电泳(6)。DNA印迹法(Southern印迹)(以它的发明者E.M.Southern的名字命名)指将DNA通过毛细管转移法,转移到尼龙或者硝化纤维素薄膜上。靶标DNA可以通过与放射性的或者化学发光的探针杂交来定位,并通过射线自显影或者染色观察到。

DNA印迹法具体的操作流程存在很多变化。这里描述了标准的方案和缓冲液以及其它溶液的配方。

所需设备

  • Whatman 3MM滤纸
  • 印迹薄膜
  • 大约高15–20 cm的一叠纸巾
  • 保鲜膜
  • 两个玻璃或者有机玻璃平板
  • 可以盛放1–2升缓冲液的缓冲液平皿(比如,玻璃平皿)
  • 支撑物(放置在缓冲液的平皿中)
  • 平板,大约1 kg重
  • 大约80°C的烤箱或者紫外透射仪
  • 摇床
为Southern印迹制备凝胶
大DNA分子片段化(可选)

长度大于10 kb的DNA片段,不能有效地转移到印迹薄膜上。为了使它们能顺利转移,需要减小这些片段的大小,这可以通过在酸环境下脱嘌呤实现,也可以通过紫外光照射实现。

酸环境下脱嘌呤——在凝胶电泳之后,立刻将凝胶完全浸没在0.2 M的HCl溶液中。轻轻摇动10分钟。在这个过程中,样品中溴酚蓝的颜色从蓝色转变成黄色,说明凝胶已经完全浸透了酸溶液。使用去离子水简单的洗涤凝胶。

小贴士:脱嘌呤步骤不应该持续太长时间,因为太短的片段与薄膜黏附的稳定性比较差。

小贴士:脱嘌呤过的凝胶会导致在最后的射线自显影中产生模糊的条带,这主要是因为在转移时,DNA片段的扩散性增强了。因此,仅在要转移长度大于10 kb的片段的时候,推荐使用脱嘌呤。

紫外光照射——将凝胶暴露在光源功率为30 W,波长为254 nm的紫外光中30–60秒。

变性

双链DNA必须变性,以便制备合适的杂交目标。将凝胶完全浸没在变性缓冲液中,轻轻摇晃,孵育30分钟。如果使用酸性条件下的脱嘌呤法使DNA变性,在孵育过程中,溴酚蓝将会逐渐转变成它原来的颜色。

复性

去除变性缓冲液,将凝胶完全浸泡在复性缓冲液中。轻轻摇晃,孵育30分钟。

变性缓冲液
工作溶液成分
成分 每升的量
1.5 M NaCl NaCl 87.7 g
0.5 M NaOH NaOH 20 g

 

复性缓冲液
工作溶液成分
成分 每升的量
1 M Tris·Cl Tris base 121.1 g
1.5 M NaCl NaCl 87.7 g
缓冲液pH 7.4。使用HCl调整至pH 7.4.

 

20x SSC
工作溶液成分
成分 每升的量
3 M NaCl NaCl 175.3 g
0.3 M Sodium citrate Sodium citrate-H2O 88.2 g
使用NaOH调整至pH 7.4 。
组装用于印迹实验的器械
  1. 将比凝胶大一些的支撑物放置在盛有10x SSC的平皿中,用玻璃或者有机玻璃平板覆盖支撑物。
  2. 剪两条比凝胶宽的Whatman 3MM滤纸,大小要适合垫在凝胶下方,长度要能达到平皿两端的底部。使用10x SSC润湿滤纸,然后将它们放置在玻璃板上。用移液管在表面前后滚动几次,以除去滤纸和支撑物之间的气泡。
  3. 剪一片用于印迹实验的薄膜和两张比凝胶四周都大1 mm左右的Whatman 3MM滤纸。
    小贴士:在使用印迹薄膜的时候,一定要佩戴手套。仔细的用手操作薄膜的边缘,或者使用干净的钝末端的钳子操作。
  4. 将准备好的凝胶上端朝下放置在平台上。用移液管在凝胶上前后滚动几次,以去除凝胶和平台之间的气泡。
  5. 使用保鲜膜包裹凝胶。这能确保10x SSC溶液穿过而不是在其周围流动。
  6. 将预先剪好的印迹薄膜放置在凝胶上面,以覆盖整个凝胶表面。印迹薄膜一旦放置在凝胶上之后,不要移动。如步骤4中所述,去除它们之间的所有气泡。
  7. 使用10x SSC润湿两张预先剪好的Whatman 3MM滤纸,然后将它们放置在尼龙膜的表面。如步骤4中所述,去除它们之间的所有气泡。
  8. 将一叠15–20 cm厚的干纸巾放置在滤纸的表面。
    小贴士:确保包裹在凝胶周围的保鲜膜能防止纸巾与10x SSC或者凝胶底部的湿滤纸接触。确保纸巾不要垂下去,因为这样它们会导致液体在凝胶周围流过,而不是穿过凝胶。
  9. 将另外一块玻璃或者有机玻璃板放置在纸巾的表面。将重物放置在玻璃板上方。转移过程大概需要12–18 h。
    小贴士:在转移过程中,至少将浸湿的纸巾更换成干纸巾一次,这样可以改善转移的效率。
将DNA固定在印迹薄膜上
  1. 在转移完成之后,去除重物,纸巾和两层滤纸。将凝胶和印迹薄膜一起翻转,凝胶一面朝上,放置在干躁的滤纸上。使用原子笔或者软芯铅笔在薄膜上标记凝胶泳道的位置。将凝胶从膜表面剥除。如果需要的话,可以保留凝胶,以评价DNA转移的效率,否则的话可以扔掉凝胶。
    在将凝胶从印迹膜表面去除的时候,确保凝胶的泳道标记出来,这样它们稍后能被分辨出来。
    为了评价DNA转移的效率,在印迹实验结束之后,使用溴化乙锭将凝胶染色,以查看还有多少DNA残留。
  2. 使用烘烤法(步骤3)或者紫外光交联法(步骤4)将DNA固定在印迹薄膜上。
    小贴士:与烘烤发相比,紫外光交联法通常可以得到更好的结果和更高的灵敏度。但是,有效的交联需要对系统进行优化。
  3. 使用这一步或者步骤4:为了使用烘烤法将DNA固定在薄膜上,首先将印迹薄膜在滤纸上晾干,然后将其放置在两层滤纸之间,在80°C的条件下,烘烤2 h。然后进行步骤5。
  4. 使用这一步或者步骤3:为了使用紫外光交联法固定DNA,首先用保鲜膜覆盖紫外光源(比如透射仪),以保护薄膜的表面。然后将潮湿的印迹薄膜的带有DNA的一面暴露在紫外光源下一定的时间。然后进行步骤5。
    小贴士:对于紫外交联,优化系统非常重要。为了做到这一点,需制备包含几个对照DNA样本的印迹薄膜。将薄膜的每条泳道剪成独立的长条,然后将每个长条照射不同的时间,从0.5 min到5 min不等。将所有的印迹薄膜同时进行杂交,确定多长时间的照射能获得最佳的信号强度。对于每一个实验,使用相同的条件(紫外光波长,到紫外光源的距离等)是至关重要的。定期标定系统也是很重要的,因为紫外光源的辐射强度,随着使用会逐渐减弱。
    小贴士:紫外光会伤害眼睛和皮肤。一定要佩戴合适的护目镜和面罩。
  5. 如果不是立即使用印迹薄膜,可以将其用保鲜膜包裹,然后储存在室温下。

DNA回收

DNA回收是有效地进行下游的实验(比如克隆、测序、微阵列分析或者扩增)的前提条件。

这需要使用专用的试剂盒,试剂盒根据反应类型、DNA片段大小(比如,PCR产物,凝胶提取物,酶反应产物,核苷酸去除,染料终止子去除)和要求洗脱体积的不同,会有差别。

标准的PCR回收,仅需要去除约20种核苷酸左右的寡聚物。在二代测序(NGS)的文库制备中,通常必须去除更大的引物——几乎达到PCR扩增子的大小范围——因此PCR回收可能不充分。对于这种特别的“大小筛选”流程,需要专用的试剂盒或者基于PEG的沉淀方法。

参考文献

  1. Ausubel, F.M., et al. (1991) Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons.
  2. Animal Genome Size Database — www.genomesize.com.
  3. Systma, K.K., Givnish, T.J., Smith, J.F., and Hahn, W.J. (1993) Collection and storage of land plant samples for macromolecular comparisons. Methods Enzymol. 234, 23.
  4. Birnboim, H.C., and Doly, J. (1979) A rapid alkaline lysis procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Acids. Res. 7, 1513.
  5. Birnboim, H.C. (1983) A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA. Methods Enzymol. 100, 243.
  6. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.
  7. Wilfinger, W.W., Mackey, M., and Chomczynski, P. (1997) Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 22, 474.
  8. Lis, T., and Schleif, R. (1975) Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acids Res. 2, 383.

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