QuantiTect Whole Transcriptome Kit

For unlimited real-time PCR analysis from precious RNA samples
  • High cDNA yields for unlimited qPCR analysis and archiving
  • Equal amplification of all cDNA and all transcript regions
  • Fast and easy protocol with optimized reagents

The QuantiTect Whole Transcriptome Kit enables the preamplification and reverse transcription of limited amounts of RNA to high yields of cDNA for unlimited gene expression analysis using real-time PCR. An optimized protocol ensures a fast and easy procedure. The kit consists of a complete set of enzymes and buffers for whole transcriptome amplification (WTA). Innovative modification of Phi 29 polymerase technology allows yields of up to 40 μg cDNA from as little as 1 ng RNA. The uniquely high processivity of this polymerase guarantees the generation of cDNA containing uniformly amplified targets to ensure reliable gene expression analysis in real-time PCR.

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QuantiTect Whole Transcriptome Kit (25)
For 25 x 50 µl reactions: 25 µl T-Script Enzyme, 400 µl T-Script Buffer, 25 µl Ligation Enzyme 1, 25 µl Ligation Enzyme 2, 200 µl Ligation Reagent, 600 µl Ligation Buffer, 25 µl REPLI-g Midi DNA Polymerase, 730 µl REPLI-g Midi Reaction Buffer
207043
¥100,000
QuantiTect Whole Transcriptome Kit (100)
For 100 x 50 µl reactions: 100 µl T-Script Enzyme, 400 µl T-Script Buffer, 100 µl Ligation Enzyme 1, 100 µl Ligation Enzyme 2, 200 µl Ligation Reagent, 600 µl Ligation Buffer, 100 µl REPLI-g Midi DNA Polymerase, 2 x 1.45 ml REPLI-g Midi Reaction Buffer
207045
¥340,000

QuantiTect Whole Transcriptome Kit  は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的には使用することはできません。


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一定したcDNA収量|5' 領域および 3' 領域を均一に増幅|操作手順|信頼できるリアルタイムPCR解析|全トランスクリプトーム増幅|転写物プロファイルの保持|
QuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いて異なる血液サンプルからのトータルRNA(10 ng)を2 時間あるいは8 時間増幅した。cDNAの収量は、PicoGreen試薬を用いて測定した。|QuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いてトータルRNA(1 ng)を増幅した。このcDNA 10 ng、β-actinに特異的なプライマー、QuantiTect SYBR® Green PCR Kit を用いてリアルタイムPCRを行なった。β-actin転写物の5'領域と3'領域に相当する増幅産物は、リアルタイムPCRで同等のCT 値で検出されたことから、QuantiTect Whole Transcriptome Kit が転写物の全領域を均等に増幅することが分かる。|cDNAは、精製RNAから3段階の反応により増幅される(逆転写、ライゲーション、全トランスクリプトーム増幅)。|replicateのRNA サンプル(各10 ng)をQuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いて増幅した。その後、Mx3005P システム上でcDNA 10 ng とQuantiFast Probe PCR Kit を用いて表示したターゲットのリアルタイムPCRを行なった。曲線が重なっていることは、再現性の高い全トランスクリプトーム増幅であることを示唆している。ACTB:β-actin、HPRT1:hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1。|RNAテンプレートからまずcDNA を合成し、その後ライゲートする(未提示)。REPLI-g DNAポリメラーゼがDNAテンプレート上を移動し相補鎖を置換する。置換したDNA鎖が複製のテンプレートになり、cDNA が高い収量で複製される。|QuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いてトータルRNA(1 ng)を2 時間(WTA 2 h)あるいは8 時間(WTA 8 h)増幅し、続いて10 ng のcDNAを用いて5 種類のターゲットをリアルタイムPCRで解析した。コントロールとして、Sensiscript RT Kit(Non-WTA)を用いてRNAを逆転写し、RT反応液の1/5をリアルタイムPCR に用いた。リアルタイムPCR はQuantiTect Probe PCR Kit を用いて行なった。[A] 5 種類の転写物の相対的な遺伝子発現レベル(HPRT1 で標準化した)は、重なった測定点が示すようにWTA 2 hWTA 8 hそしてNon-WTAサンプルにおいて同じ程度である。[B] Non-WTAサンプル(X軸)のΔCT値に対してWTA 8 hサンプル(Y 軸)のΔCT値(各ターゲットのCT 値からインターナルリファレンスであるβ-actinのCT 値を差し引いた値)をプロットしたグラフは高い直線性を示している。 [A]および[B]のデータはQuantiTect Whole Transcriptome Kit が転写物プロファイルを保持していることを証明している。TP53:Tumor protein p53、NFKB1:nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1、HPRT1:hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1、TBP:TATA box binding protein、TNFRSF6B:tumor necrosis factor receptor superfamily、member 6b、decoy。|
パフォーマンス

The QuantiTect Whole Transcriptome Kit provides highly uniform amplification of all transcripts, which is essential for reliable gene expression analysis. All mRNA transcripts are amplified with equal representation at both 5' and 3' regions (see figure "Equal amplification of 5' and 3' regions"). Preservation of the transcript profile is demonstrated in the figure "Preservation of transcript profile", where WTA-amplified cDNA prepared using the QuantiTect Whole Transcriptome Kit is compared with nonamplified cDNA prepared using a reverse transcriptase.

High and reproducible cDNA yields of up to 40 μg can be achieved (see figure "Reproducible cDNA yields"). This allows unlimited real-time PCR analysis with highly reproducible CT values (see table and figure "Reliable real-time PCR analysis"). In addition, since cDNA is more stable than RNA, it can be safely archived for future studies.

High yields of cDNA for real-time PCR analysis
Starting materialAmplification time Typical yield of amplified productNumber of real-time PCR analyses*
10 ng RNA 2 hours Up to 10 µg cDNA 1000
10 ng RNA 8 hours Up to 40 µg cDNA 4000
* Number of real-time PCR analyses possible using cDNA from a single QuantiTect whole transcriptome amplification (WTA) reaction. Without WTA, only 1 reliable real-time RT-PCR analysis is possible from 10 ng RNA.
原理

Gene expression profiling can be limited by the small amount of biological sample available. By using the QuantiTect Whole Transcriptome Kit, unlimited real-time PCR analyses of small and precious samples are possible. The QuantiTect Whole Transcriptome Kit is optimized for whole transcriptome amplification from as little as 1 ng RNA, or RNA corresponding to about 50 cells. Even lower amounts of RNA can be used, depending on the quality of the RNA and the abundance of the transcript of interest.

The QuantiTect Whole Transcriptome Kit contains reverse transcriptase, DNA polymerase, and optimized buffers and reagents for the amplification of all transcripts within an RNA sample. The kit integrates cDNA synthesis with the proven quality of REPLI-g technology for nonbiased sequence amplification. REPLI-g amplification uses Multiple Displacement Amplification (MDA) technology, which carries out isothermal sequence amplification using a uniquely processive DNA polymerase (see figure "Whole transcriptome amplification"). This technology ensures unbiased amplification of all transcript regions, even of 5' ends, providing unlimited cDNA highly suited for real-time PCR.

操作手順
Unlimited cDNA representing the entire transcriptome is prepared from total RNA in a simple 3-step protocol (see flowchart "Procedure"). RNA is first reverse transcribed into cDNA using an optimized reverse transcription mix containing T-Script Enzyme with random and oligo-dT primers. The synthesized cDNA is ligated using a high-efficiency ligation mix, and then amplified using an amplification mix based on proven REPLI-g technology.
アプリケーション

cDNA prepared using the QuantiTect Whole Transcriptome Kit is intended for use in real-time PCR analysis with QuantiFast or Rotor-Gene Kits and can be archived for future analysis. The cDNA is not suitable for use in microarray analysis. For whole genome amplification from small or precious samples, QIAGEN offers REPLI-g kits and REPLI-g Service. Amplification is highly uniform with minimal sequence bias, providing DNA suitable for applications such as genotyping and Comparative Genome Hybridization (CGH).

Feature
Specifications
Amplification Whole total RNA
Applications Real-time PCR, gene expression analysis
Maximum input volume 5 µl total RNA
Minimal pipetting volume needed 1 µl
Reaction time 5 hours or 11 hours
Reaction volume 50 µl
Samples per run (throughput) Mid
Starting amount of total RNA >10 ng purified total RNA
Starting material Purified total RNA
Technology Reverse transcription followed by ligation and multiple displacement amplification (MDA)
Yield 10 µg or 40 µg cDNA

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FAQ
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FAQ ID -3080
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キットハンドブック
2
For preparation of cDNA from total RNA by whole transcriptome amplification
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全トランスクリプトーム増幅によりトータルRNAからcDNAを調製
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画像
Reproducible cDNA yields.
一定したcDNA収量
QuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いて異なる血液サンプルからのトータルRNA(10 ng)を2 時間あるいは8 時間増幅した。cDNAの収量は、PicoGreen試薬を用いて測定した。
Equal amplification of 5' and 3' regions.
5' 領域および 3' 領域を均一に増幅
QuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いてトータルRNA(1 ng)を増幅した。このcDNA 10 ng、β-actinに特異的なプライマー、QuantiTect SYBR® Green PCR Kit を用いてリアルタイムPCRを行なった。β-actin転写物の5'領域と3'領域に相当する増幅産物は、リアルタイムPCRで同等のCT 値で検出されたことから、QuantiTect Whole Transcriptome Kit が転写物の全領域を均等に増幅することが分かる。
QuantiTect Whole Transcriptome procedure.
操作手順
cDNAは、精製RNAから3段階の反応により増幅される(逆転写、ライゲーション、全トランスクリプトーム増幅)。
Reliable real-time PCR analysis
信頼できるリアルタイムPCR解析
replicateのRNA サンプル(各10 ng)をQuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いて増幅した。その後、Mx3005P システム上でcDNA 10 ng とQuantiFast Probe PCR Kit を用いて表示したターゲットのリアルタイムPCRを行なった。曲線が重なっていることは、再現性の高い全トランスクリプトーム増幅であることを示唆している。ACTB:β-actin、HPRT1:hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1。
Schematic representation of REPLI-g amplification
全トランスクリプトーム増幅
RNAテンプレートからまずcDNA を合成し、その後ライゲートする(未提示)。REPLI-g DNAポリメラーゼがDNAテンプレート上を移動し相補鎖を置換する。置換したDNA鎖が複製のテンプレートになり、cDNA が高い収量で複製される。
Preservation of transcript profile.
転写物プロファイルの保持
QuantiTect Whole Transcriptome Kit を用いてトータルRNA(1 ng)を2 時間(WTA 2 h)あるいは8 時間(WTA 8 h)増幅し、続いて10 ng のcDNAを用いて5 種類のターゲットをリアルタイムPCRで解析した。コントロールとして、Sensiscript RT Kit(Non-WTA)を用いてRNAを逆転写し、RT反応液の1/5をリアルタイムPCR に用いた。リアルタイムPCR はQuantiTect Probe PCR Kit を用いて行なった。[A] 5 種類の転写物の相対的な遺伝子発現レベル(HPRT1 で標準化した)は、重なった測定点が示すようにWTA 2 hWTA 8 hそしてNon-WTAサンプルにおいて同じ程度である。[B] Non-WTAサンプル(X軸)のΔCT値に対してWTA 8 hサンプル(Y 軸)のΔCT値(各ターゲットのCT 値からインターナルリファレンスであるβ-actinのCT 値を差し引いた値)をプロットしたグラフは高い直線性を示している。 [A]および[B]のデータはQuantiTect Whole Transcriptome Kit が転写物プロファイルを保持していることを証明している。TP53:Tumor protein p53、NFKB1:nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1、HPRT1:hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1、TBP:TATA box binding protein、TNFRSF6B:tumor necrosis factor receptor superfamily、member 6b、decoy。