dPCRの初心者向け’ガイド – ラボに持ち込んで開始するためのヒントとリソースを見つける
ナノプレートdPCRベーシックス
QIAcuity ナノプレート dPCRワークフローには、ピペッティング、ロード、実験の実行、結果の分析という3つの基本的なステップが含まれます。原則として、この概念はqPCRと同じです。重要な違いは、定量コストを維持しながらの精度と感度の向上にあります。
ステップ1：調製し、ロード
最初のステップとして、サンプルの準備が重要です。DNAの量と純度を測定することをお勧めします。アプリケーションに応じて、サンプルはさまざまな希釈率でもテストできます。大量のPCR阻害物質を含まない純粋なサンプルを使用したほうが有利です。サンプル調製の詳細については、QIAcuityアプリケーションガイドをご参照ください。
次に、dPCRパラメーターの – プライミング、サイクリング、イメージングプロファイル、反応ミックス、サンプルとコントロール、プレートレイアウトを定義して、QIAcuity Software Suiteで実験を作成します。プレートが定義されると、実ランの準備が整います。QIAcuity PCRマスターミックスをサンプル、プライマー、RNaseフリー水、およびオプションで制限酵素と組み合わせて、プレプレートで反応ミックスを調製します。最終反応量は、使用するQIAcuity ナノプレートによって異なります。次に、調製した反応ミックスをピペットでナノプレートに入れます。蒸発と汚染を防ぐために、ナノプレートは適切に密封する必要があります。ローラーを使用して、プレートのマクロ構造にホイルを固定します。良好な充填結果を得るには、手動でロールしてプレートシールを適切に固定することが重要です。プレートをサイドエッジまたはトレイで保持し、振ったり回転させたりせずにスムーズにQIAcuityに輸送し、確実に反応ミックスが入力ウェルの底にあるようにすることが不可欠です。装置とスイートが接続されると、すべてのモジュールを使用できるようになり、プレートをロードして開始できます。
ステップ2：ランセットアップと増幅
ナノプレートをロードすると、装置はスロットを青色で強調表示し、バーコードをスキャンします。コントロールソフトウェアで以前に設定した好ましい実験は、プレートにリンクでき、プライミング、サイクリング、イメージングプロファイルが定義され、ランが開始されます。
まず、ナノプレートをプライミング／ローリングモジュールで処理します。このステップでは、各ウェルの反応ミックスが1,000の小さな個々の反応に分割されます。次に、PCRがサーモサイクラーで実行されます。どちらか一方のパーティション内の適切なテンプレート材料が、イメージング中に検出される陽性蛍光シグナルにつながります。画像はQIAcuity Software Suiteに送信され、画像処理されます。
装置画面またはSoftware Suiteのいずれかで、現在のプレートステータスを表示できます。
ステップ3：結果を分析
分析するには、絶対定量、突然変異検出、ゲノム編集、コピー数多型、遺伝子発現のいずれかを選択します。絶対定量分析では、優先ウェルとターゲットまたは検出チャンネルのいずれかを選択するだけです。リストビューには、濃度、信頼区間、および有効な陽性と陰性のパーティションが表示されます。ヒートマップビューには、リファレンスチャンネルと共にターゲットチャンネルが表示されます。閾値設定を変更するには、ヒストグラム、1D散布図、または2D散布図のいずれかを使用します。変更された閾値に基づいて結果を取得するには、“再計算”をクリックします。
デジタルPCRのトラブルシューティングと最適化
