QuantiFast Pathogen + IC Kits

内部コントロールを含むウイルスRNA/DNAおよび細菌DNAの高感度かつ信頼性の高い検出

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✓ 迅速で信頼性の高い（再）注文

QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit (400)

カタログ番号 / ID. 211454

400 x 25 µl反応の場合：Master Mix、RT Mix、lyophilized Internal Control Assay、lyophilized Internal Control RNA、ROX Dye Solution、High-ROX Dye Solution、RNase-Free Water、Nucleic Acid Dilution Buffer、Buffer TE

キットコントロール

QuantiFast Pathogen Kit

Internal Control

タイプ

RT-PCR

PCR

お問い合わせください

商標を参照

QuantiFast Pathogen + IC Kitsは分子生物学的アプリケーション用であり、疾病の診断、予防、あるいは治療に使用することはできません。

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特徴

病原体ターゲットと内部コントロールを同時検出
より多くのサンプルインプットでより高い感度が得られる5xマスターミックス
プロセス安全性を高める陰性結果の正しい解釈
弱い陽性ターゲットシグナルを明確に検出
標準サイクラーと高速サイクラーの両方で、迅速なユニバーサルプロトコール

製品詳細

QuantiFast Pathogen +IC Kitsは、配列特異的プローブを使用して、病原体核酸を高感度で迅速に、リアルタイムPCRまたは1ステップRT-PCR検出ができるように設計されています。陰性検出結果を正しく解釈することで高いプロセス安全性を可能にするため、各キットには最大4つのユーザー定義の病原体ターゲット（ウイルス、細菌、真菌など）とInternal Control（IC）のマルチプレックスリアルタイム検出を行う試薬が含まれています。キットには2つの形式があります。ウイルスRNA検出用のQuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit（内部RNAコントロールテンプレートとInternal Controlプライマー/プローブセットを含む）、またはウイルス、細菌、真菌DNA検出用のQuantiFast Pathogen PCR +IC Kit（内部DNAコントロールテンプレートとInternal Controlプライマー/プローブセットを含む）です。どちらのキットでも、ROXは濃度の異なる2本のチューブで提供され、事実上どのリアルタイムPCR装置でも使用できます。マスターミックスは2～8℃で保存できるので便利です。

パフォーマンス

QuantiFast Pathogen +IC Kitsは、マルチプレックス時に感度を損なうことなく、広い直線範囲にわたってウイルスRNAまたはDNAターゲットと付属のInternal Controlを同時に検出できます（図 Rotor-Gene Qでのノロウイルスの高感度検出およびシングルプレックスおよびデュプレックス検出の高い直線性と精度参照）。このプロトコールは、ほとんどのサイクラーで、高速サイクリング実験を高い信頼性で実行できるように開発されています（図「 Rotor-Gene QでのBHV-1の高感度検出」および「 ABI 7500でのBHV-1の高感度検出」参照）。QuantiFast Pathogen +IC Kitsを使用して病原体ターゲットとInternal Controlを組み合わせて増幅すると、陰性結果の正しい解釈が保証され、病原体検出ワークフローのプロセス安全性が向上します（図「陰性結果の正しい解釈」参照）。

キットに付属するQuantiTect Nucleic Acid Dilution Bufferは、希釈および反応セットアップ中にRNAおよびDNAスタンダードを安定化し、チューブやピペットチップのようなプラスチック表面での核酸の損失を防ぎます。ウイルス核酸定量に使用する標準の信頼性の高い希釈を可能にし、低～高C_T値の広い直線範囲が得られます。このバッファーは、変性することなくスタンダードを長期保存できます（図「信頼性の高いRNA標準の希釈と保存」参照）。

図参照

ノロウイルスの高感度検出。

シングルプレックスおよびデュプレックス検出の高い直線性と精度。

Rotor-Gene QでBHV-1を高感度検出。

ABI 7500でBHV-1を高感度検出。

陰性結果の正しい解釈。

RNAスタンダードの信頼性の高い希釈と保管。

原理

陰性結果を正しく解釈することで高いプロセス安全性を可能にするため、各QuantiFast Pathogen _IC Kitには、ユーザー定義の病原体ターゲットとInternal Controlをマルチプレックスでリアルタイム検出するための試薬が含まれています。コントロール遺伝子と標的遺伝子を別々の反応ではなく、同じ反応で増幅することで、ハンドリングエラーが最小限に抑えられ、遺伝子定量の信頼性が向上します。

QuantiFast Pathogen +IC Kitsは、病原体核酸の高感度かつ迅速なリアルタイムマルチプレックスPCRまたは1ステップ RT-PCR検出を最初の試みで実現します（フローチャート「 QIAGENマルチプレックスキット」参照）。最適化されたマスターミックスは、マルチプレックス反応時にPCR産物が、対応するシングル増幅反応時のPCR産物と同じ効率と感度で増幅されることを保証します。特別に開発された高速PCRバッファーには、変性、アニーリング、伸長時間を大幅に短縮する新しい添加剤Q-Bondが含まれています（図「高速プライマーアニーリング」参照）。K⁺イオンとNH₄⁺イオンのバランスのとれた組み合わせと独自の合成Factor MPにより、プライマーとプローブの核酸テンプレートへの安定的かつ効率的なアニーリングが促進され、高いPCR効率が可能になります（図「独自のPCRバッファー」参照）。さらに、Sensiscript Reverse Transcriptaseの独自の組成により、ウイルスRNAの高感度逆転写が保証され、HotStarTaq Plus DNA Polymeraseにより厳密なホットスタートが提供され、非特異的産物の形成が防止されます。

QuantiFast Pathogen +IC Kitのコンポーネント
	キットのコンポーネント	特徴	メリット
5x QuantiFast Pathogen PCR Master Mix	濃縮マスターミックス	病原体を高感度で検出できるように高濃度で最適化	感度を上げるため、より多くのテンプレート量をアッセイに添加可能
	HotStarTaq Plus DNA Polymerase	95ºC 5分で活性化	室温でqPCR反応をセットアップ
	QuantiFast Pathogen Buffer	NH₄⁺イオンとK⁺イオンのバランスの取れた組み合わせ	特異的なプライマーアニーリングにより信頼性の高いPCR結果を保証
		合成Factor MP	同じチューブで最大4つの遺伝子を高い信頼性でマルチプレックス分析
		独自のQ-Bond添加剤	PCRの実行時間が短縮され、より迅速に結果を得て、1日あたりの反応数が増加
Internal Control Assay	Internal Controlテンプレート	QuantiFast Pathogen PCR +IC KitのInternal Control DNAテンプレート	さまざまな病原体アッセイで使用できるユニバーサルDNA増幅コントロール
	Internal Controlテンプレート	QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC KitのInternal Control RNA	さまざまな病原体アッセイで使用できるユニバーサルRNA増幅コントロール
	Internal Control Assay	MAX（HEX、VICなどに相当）で標識したプレミックスプライマー／プローブセット（TaqMan®プローブ）	病原体-標的に対するプライマーに干渉しない
追加キットコンポーネント	QuantiFast Pathogen RT Mix*	Sensiscript Reverse Transcriptaseの独自の組成を含む	病原体RNAの高感度検出用に最適化
	ROX Dye Solution	Applied Biosystems 7500 real-time PCRシステムで蛍光シグナルを正規化するためのパッシブレファレンス色素の個別チューブ。オプション：AgilentのStratagene装置で使用できます	ROX色素を必要とするサイクラーで正確な定量。どのリアルタイムPCRサイクラーでもPCRに干渉しません
	High-ROX Dye Solution	Applied Biosystems 7900とStepOne real-time PCRシステムで蛍光シグナルを正規化するためのパッシブレファレンス色素の個別チューブ	ROX色素を必要とするサイクラーで正確な定量。どのリアルタイムPCRサイクラーでもPCRに干渉しません
	QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer	核酸スタンダードの希釈および保存のための独自のバッファー組成	希釈および反応セットアップ中のRNAおよびDNAスタンダードを安定化し、チューブやピペットチップなどのプラスチック表面での核酸のロスを防ぎます。

* QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kitsにのみ含まれます

図参照

QIAGEN multiplex kits

迅速なプライマーアニーリング。

Unique PCR buffer

操作手順

QuantiFast Pathogen +IC Kitsは、ユーザー定義の病原体とInternal Controlを検出するための簡便な手順を提供します。キットには、ウイルスRNA（1ステップRT-PCR）またはウイルス、細菌、真菌DNA（PCR）をリアルタイムで検出するための、すぐに使用できるマスターミックスが含まれています。反応条件やサイクリング条件を最適化する必要はありません。付属のマスターミックスと病原体アッセイ（プライマーとプローブ）、付属のInternal Control AssayとInternal Control DNAまたはRNAを混合するだけです。あるいは、サンプル精製手順にInternal Controlを加える場合は、Internal Control DNAまたはRNAの代わりにRNaseフリー水を反応ミックスに加えます。その後、サンプルDNAまたはRNAを加え、任意のサイクラーで反応を開始します。キットのハンドブックには、さまざまなサイクラーでTaqMan®プローブを使用することができるように最適化されたプロトコールが含まれています。また、色素の組み合わせの選択に関する推奨事項も記載されています。

各QuantiFast Pathogen +IC Kitには、反応ミックスに直接添加して増幅コントロールとして使用するためのInternal Control AssayとInternal Control DNAまたはRNAが含まれています。あるいは、ICを精製手順に追加して、精製プロセスと増幅の両方をコントロールすることもできます。精製手順にInternal Controlを追加するには、高濃度のInternal Control DNAまたはRNA（高濃度）を別途注文できます（図「 QIAGEN Internal Control」参照）。

図参照

QIAGEN Internal Control

アプリケーション

QuantiFast Pathogen +IC Kitsは、内部コントロールを含む病原体DNAおよび/またはRNAの検出に配列特異的プローブを使用する高感度real-time PCR または1ステップRT-PCR を提供します。このキットは、QIAGEN、Applied Biosystems、Bio-Rad、Roche（キャピラリーサイクラーを除く）、Agilentのサイクラーを含む幅広いリアルタイムPCRサイクラーで使用できます。

裏付けデータと数値

陰性結果の正しい解釈。

ウイルスRNAターゲットの2つの濃度の複製を、Rotor-Gene Qにおいて、さまざまな量のPCR阻害物質（フミン酸）存在下で、内部コントロールと共に増幅しました。[A] テンプレートなしのコントロール（NTC）は、内部コントロールシグナルの参照として機能します。[B] ウイルスRNAターゲットと内部コントロールの増幅により、増幅が成功したことが確認されます。[C] 内部コントロールは少量の阻害剤の存在を示しています。[D] 内部コントロールが検出されない場合、阻害剤の存在により増幅反応が失敗したことが示されます。

仕様

特徴	仕様
Applications	病原体の検出：ウイルス、細菌、または真菌DNAのreal-time PCR（QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit）またはウイルスRNA検出用の1ステップRT-PCR（QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit）
Sample/target type	QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit：ウイルス、細菌、または真菌DNA；QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit：ウイルスRNA
Single or multiplex	デュプレックス
Reaction type	内部コントロール（IC）を含むリアルタイムPCRまたは1ステップRT-PCR
Real-time or endpoint	リアルタイム
SYBR Green I or sequence-specific probes	配列特異的プローブ
Thermal cycler	デュプレックスPCR/RT-PCRに対応するほとんどの標準的な高速リアルタイムサイクラー（Rotor-Gene Q、またはAgilent、Applied Biosystems、BioRad、Rocheのサイクラーなど）
With or without ROX	マスターミックスにはROX色素は含まれていませんが、2種類のROX溶液が含まれています：ABI 7500以外のABIサイクラーで使用するHigh-ROX Dye Solution、ABI 7500およびその他のサプライヤーで使用するROX Dye Solution（低ROX濃度）

リソース

Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.

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よくある質問

The QuantiTect Virus Kit and the new QuantiFast Pathogen +IC Kits are based on similar reaction chemistry and show identical sensitivity but as a new feature, the QuantiFast Pathogen kits include an Internal Control template and the corresponding primer/probe set for duplex amplification of a user-defined pathogen target with the provided Internal Control. Additional new features are pack size, kit variants, ROX variants, and speed.

FAQ-2448

In the QuantiFast Pathogen + IC kit, the probe is labeled with MAX-NHS ester (MAX) as the reporter dye which has a spectrum equivalent to HEX, JOE or VIC dyes. IowaBlack is used as the quencher dye. IowaBlack is a non-fluorescent quencher (dark quencher).

FAQ-2449

The DNA IC is a non-linearized plasmid. The RNA IC is an in vitro transcript. Both are naked nucleic acids. The size (base pair length) of both templates is sufficient to allow for efficient purification with standard methods for nucleic acid extraction.

FAQ-2450

Yes, the Internal Control RNA (High conc.) and Internal Control DNA (High conc.) templates are available under a separate catalog number. After reconstitution according to the description in the handbook, these IC templates have a 10x higher concentration than the Internal Control templates provided in the kits. They are sufficiently concentrated to be spiked into the sample prep without replacing too much of the sample input volume.

**Please note that there is no assay (primer/probe set) for amplification of the IC included in these separate catalog numbers. The assay is only included in the QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit and QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit. The ICs cannot be used with the QuantiTect Virus kits because the assay (primer/probe set) for the detection of the IC is provided with the QuantiFast Pathogen Kits only.

FAQ-2451

Using the QuantiFast Pathogen + IC kits on the Rotor-Gene Q:

RT-PCR
40 cycles	~95 minutes
45 cycles	~100 minutes

PCR
40 cycles	~75 minutes
45 cycles	~80 minutes

FAQ-2452

The detection limit for the QuantiFast Pathogen RT-PCR and PCR kits is < 10 copies.

FAQ-2453

Typically, the target-specific probe should be labeled with FAM as the reporter dye and a non-fluorescent quencher (e.g., Dark Quencher, Black Hole Quencher [BHQ] or Iowa Black Quencher). Other reporter dyes than FAM, detected in a different detection channel than MAX, may also be suitable. It is not recommended to use fluorescent quenchers (e.g., TAMRA fluorescent dye). Due to their own native fluorescence, fluorescent quenchers contribute to an overall increase in background and reduce the signal-to-noise ratio.

FAQ-2594

No, the QuantiFast Pathogen PCR +IC kits are designed for use with hydrolysis probes (also known as TaqMan® probes) only.

See trademarks.

FAQ-2595

The QuantiFast Pathogen PCR + RT-PCR +IC Kits can be used on all leading block cycler platforms, but not on capillary systems (e.g., LightCycler 2.0).

FAQ-2596

MAX can be detected using the same channels or filters as for HEX, JOE, or VIC.

FAQ-2597

No, the Internal Controls used in the QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit and the QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit are an artificial sequence that is not present in biological sample material.

FAQ-2598

The Internal Control templates can be freeze-thawed for up to 6 times without decrease in performance. However, great care should be taken to avoid inadvertently introducing RNAses/DNAses into the Internal Control template solutions. In general, in order to avoid repeated freeze-thaw cycles, we recommend preparing aliquots of the Internal Control templates.

FAQ-2599

When the IC is added to the amplification reaction mix, the IC signal confirms that PCR amplification has been successful. When it is added at the extraction step to the lysis buffer or lysate, the IC signal confirms that nucleic acid purification and PCR amplification have been successful.

FAQ-2600

Yes, the Internal Control RNA will only give the expected signal when both the reverse transcription and the PCR reactions have been successful.

FAQ-2601

No, the Internal Control template DNA or RNA must be added to the lysis buffer or to the lysate in order to prevent the loss of Internal Control template thorough matrix effects.

FAQ-2602

After reconstitution according to handbook instructions, the Internal Control (IC) templates provided with the kits have a ready-to-use concentration for direct use as an amplification control in PCR or RT-PCR. For each 25 µl reaction, 2.5 µl of the IC are added, resulting in an expected CT value of approximately 29-30.

In order to achieve the same CT value when using the IC as an extraction control, more IC template has to be spiked in before extraction. The exact amount depends mainly on the elution volume. For each 1 µl of elution volume, 0.1 µl of the IC High conc. should be added to each of the extraction samples. This should result in a CT value in the PCR or RT-PCR reactions of approximately 29-30.

Examples: For 100 µl of elution volume, 10 µl of the IC, per sample, should be added to the lysis buffer or lysate. For 50 µl of elution volume, 5 µl of the IC, per sample, should be added to the lysis buffer or lysate.

FAQ-2603

Principally, yes. However, additional factors influencing the CT are:

1. Extraction efficiency, which depends on extraction method and sample material.

2. Volume of the eluate used for PCR.

Examples: Use of the Internal Control according to handbook instructions (0.1µl per 1µl elution volume) for two different workflows.

Workflow 1: High extraction efficiency: use of 5 µl of the eluate for PCR results in a CT value of 29-30.
Workflow 2: High extraction efficiency: use of 10 µl of the eluate for PCR results in a CT of 28-29.

Depending on the workflow, the amount of Internal Control to be added to the extraction might have to be adjusted to more than 0.1 µl per 1 µl elution volume, or to less than 0.1 µl per 1 µl elution volume, in order to achieve a CT value within the expected range.

Running the Internal Control DNA/RNA provided with the QuantiFast Pathogen +IC Kit in a separate reaction can serve as a reference for adjusting the amount of Internal Control DNA/RNA (High conc.) to be added to the extraction.

FAQ-2604

The QuantiFast Pathogen PCR +IC Kit and the QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit are supplied with master mixes that do not contain ROX. Instead, 2 different ROX concentrations are supplied in separate tubes. “High-ROX Dye Solution” is suitable for use with all ABI cyclers except ABI 7500, and “ROX Dye Solution” is suitable for use with ABI 7500 and, optionally, instruments from Stratagene (Agilent). Recommendations are provided in the handbook.

FAQ-2605

Both membrane and magnetic bead-based kits have been tested (e.g., QIAamp MinElute Virus Kit, QIAamp Viral RNA Kit, DNeasy kits, RNeasy kits, QIAsymphony Virus/Bacteria kits, QIAxtractor Vx Reagents).

FAQ-2606

On the Rotor-Gene Q, setting the threshold in the Yellow channel to an absolute value of 0.05 will give satisfactory results in most cases.

FAQ-2607

Please follow the instructions in the handbook. Briefly, use gain optimization “Before First Acquisition” for the pathogen assay (FAM) in the Green channel, and use a fixed gain of 9 for the Internal Control Assay (MAX) in the Yellow channel.

FAQ-2608

In the “Filter Gain Settings” dialog box, set the filter gain to a value of 4 for both the FAM/SYBR Green and HEX/JOE/VIC filters. See the Mx instrument/software manual for details.

FAQ-2609

No calibration for MAX is needed if the instrument is calibrated for VIC. Use the FAM/SYBR Green filter for the pathogen assay and the VIC/JOE filter for the IC assay. To detect the Internal Control (MAX) in the VIC/JOE filter, create a new detector (e.g., “MAX/IowaBlack”). Assign “VIC” as the reporter dye and “None” for the quencher dye.

FAQ-2610

The Ct or threshold cycle value is the cycle number at which the fluorescence generated within a reaction crosses the fluorescence threshold, a fluorescent signal significantly above the background fluorescence. At the threshold cycle, a detectable amount of amplicon product has been generated during the early exponential phase of the reaction. The threshold cycle is inversely proportional to the original relative expression level of the gene of interest.

FAQ-2682

Replicates in real-time PCR may have different plateau heights due to differences in the reaction kinetics for each sample. Even though replicates start out with identical template amounts, the rate at which reagents are being depleted, and the point when exponential accumulation of PCR product stops and becomes linear, differ between replicates. This will result in different plateau heights, the stage where PCR reactions have come to a halt, and little or no additional PCR product is being amplified. You can find further information in Chapter 'Quantification of target amounts' of our Brochure "Critical Factors for Successful Real-Time PCR".

FAQ-539

Make sure that template, primers, probes, and amplification reagents are stored correctly and avoid multiple freeze–thaw cycles for oligonucleotides and template. Check the performance of your real-time instrument as some instruments require the halogen lamp to be frequently replaced. Lasers must also be replaced occasionally.

FAQ-589

TB Management

Transplant

Infectious Disease

Oncology

Sexual & Reproductive Health

Sample Processing

Solutions for Laboratory-Developed Tests

QuantiFast Pathogen + IC Kits

内部コントロールを含むウイルスRNA/DNAおよび細菌DNAの高感度かつ信頼性の高い検出

QuantiFast Pathogen RT-PCR +IC Kit (400)

特徴

製品詳細

パフォーマンス

図参照

原理

図参照

操作手順

図参照

アプリケーション

裏付けデータと数値

陰性結果の正しい解釈。

仕様

リソース

よくある質問