Guía de dPCR para principiantes: QIAGEN

Evolución de las dPCR

Las preguntas que se plantean en las complejas tareas de investigación de la actualidad requieren un nivel de detalle de información superior al que proporcionan las tecnologías PCR convencionales. Las PCR digitales de tercera generación se acercan en gran medida a dicho nivel de detalle y representan una técnica mucho más práctica y sencilla de enfrentarse a estas cuestiones.

El concepto de la técnica de la PCR digital surgió en 1992, cuando Skyes et al. lo definieron como “PCR de dilución limitante”. Este método genérico utilizaba el análisis convencional y las estadísticas de Poisson para cuantificar el número absoluto de moléculas de ácido nucleico presentes en cada muestra. Posteriormente, llegó la labor revolucionaria de Vogelstein y Kinzler en 1999, quienes desarrollaron un método en el que la muestra se diluía y se distribuía en reacciones individuales, denominadas “particiones”, y se detectaban y analizaban productos individuales con señales fluorescentes tras la amplificación. Ellos fueron quienes acuñaron el término “PCR digital” tal y como lo conocemos en la actualidad.

A lo largo de los años, estos métodos se han innovado y comercializado hasta alcanzar un uso generalizado. Se pueden realizar PCR digitales en discos y chips de microfluidos, micromatrices, microgotículas, microcristales basados en emulsiones de agua y aceite, y, desde hace poco, en placas similares a las de las qPCR.

¿Sigue buscando respuestas sobre qué es una PCR digital? Consulte nuestra guía de referencia para obtener más información sobre los fundamentos, las ventajas, las limitaciones y las aplicaciones de la PCR digital.

Descubra lo que la PCR digital puede hacer por usted

La PCR digital permite la cuantificación absoluta de ácidos nucleicos sin necesidad de referencias o curvas estándar. El método, que divide la muestra en miles de reacciones individuales, presenta una alta tolerancia a los inhibidores, una precisión superior, una mayor sensibilidad y una elevada reproducibilidad. Debido a estas características, cada vez más investigadores están empleando las PCR digitales en sus análisis de variación del número de copias, detección de mutaciones raras, detección de carga vírica, análisis de expresión génica, cuantificación de genotecas de secuenciación de última generación y otras aplicaciones.

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Cuantificación absoluta en 4 pasos

Dilución de la muestra y preparación de la mezcla de reacción de la PCR

Azul: elemento diana Rojo: fondo (ADNg, ADNc, cebadores/sondas, mezcla maestra)

Reacción de PCR dividiéndose en miles de reacciones individuales.

Amplificación de particiones por PCR punto final

Verde: reacciones positivas Azul: reacciones negativas

Lectura y cuantificación absoluta

Divida y vencerá

Aunque la muestra se prepara de manera similar a las muestras para qPCR, la división de la muestra, en la que se divide en miles de reacciones individuales antes de la amplificación, es un paso exclusivo de las PCR digitales. Mediante la distribución aleatoria de las moléculas en particiones, a diferencia de los análisis en bloque de las qPCR, las PCR digitales minimizan el efecto de las moléculas diana que compiten entre sí y mejoran la precisión y la sensibilidad en la detección de moléculas poco frecuentes.

Esta opción permite a los investigadores:

Cuantificar moléculas diana de baja abundancia o en señales de fondo complejas
Detectar y diferenciar variantes alélicas (SNP)
Supervisar pequeños cambios en los niveles de moléculas diana que no pueden detectarse mediante qPCR

Las 3 ventajas principales de la estrategia de partición

Aumenta la concentración efectiva

Mejora el límite de detección (Limit of Detection, LOD)
Amplía y detecta las moléculas de diana única

Confiere efecto de enriquecimiento

Aumenta el ratio diana–fondo

Proporciona una precisión y linealidad óptimas

Mide moléculas individuales frente a la concentración de conjunto
A mayor número de particiones la precisión es más alta
A mayor número de particiones, mayor será el rango dinámico

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La ecuación de Poisson da sentido al método de división

Al contrario de lo que ocurre con las real-time qPCR, las PCR digitales no dependen de cada ciclo de amplificación para determinar la cantidad relativa de moléculas diana. Más bien, funcionan mediante las estadísticas de la ecuación de Poisson para determinar la cantidad de moléculas diana absolutas tras la amplificación convencional.

Debido a que la molécula diana está distribuida al azar en las distintas partes disponibles, la distribución según la ecuación de Poisson calcula el número de moléculas medio de cada partición (cero, una o varias) y calcula las copias de la molécula diana por cada partición positiva. El análisis estadístico de Poisson del número de reacciones positivas y negativas da lugar a una cuantificación precisa y absoluta de la secuencia de la diana.

Aplicación de la estadística para la cuantificación absoluta

En el contexto de los experimentos de PCR digitales, la cuantificación absoluta depende de la distribución aleatoria de las moléculas diana en las particiones, y los datos deben responder a una distribución de Poisson. La distribución de Poisson recibe su nombre del matemático francés Siméon Denis Poisson en 1837 y se aplica a la probabilidad de un número determinado de eventos en cierto periodo si los eventos ocurren a una velocidad constante conocida y son independientes de la ocurrencia del evento anterior.

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Respuestas breves y preguntas frecuentes sobre la PCR digital

La cuantificación absoluta mediante PCR digital hace un recuento del número de moléculas presentes en una muestra. No se requiere ningún estándar conocido. En la cuantificación absoluta con método de curva estándar de qPCR, los elementos desconocidos se cuantifican con una cantidad conocida. La cuantificación relativa emplea una muestra de referencia para comparar y determinar el número de copias originales del ADN del molde en la reacción de interés relativa a la muestra de referencia.

Las aplicaciones de las técnicas de PCR incluyen la determinación de la presencia o ausencia de un ácido nucleico diana, el genotipado, la cuantificación de la expresión génica, la validación de ensayos, la detección de elementos diana microbianos y la cuantificación de genotecas de NGS, entre otras.

La PCR digital es un método exacto para la cuantificación de ácidos nucleicos. Existen estudios que muestran que la dPCR mejora notablemente la precisión en la resolución de un pequeño número de copias o en el recuento de moléculas simples, especialmente en presencia de inhibidores o poblaciones nativas. La PCR digital tiene límites de detección más bajos y mayor reproducibilidad intralaboratorio en comparación con la qPCR tradicional.

Le gustará saber que la reacción inicial de una dPCR se prepara a partir de componentes de ensayo habituales que ya conoce, similares a las de las qPCR. Después, mediante la discretización o división de cada muestra en un número más amplio de reacciones individuales y paralelas, le quedarán una o varias moléculas diana en algunas de las particiones, e incluso puede que otras no contengan ninguna. La división puede conseguirse dividiendo cada muestra dentro de microplacas que contienen capilares o canales, matrices de cámaras en miniaturas o emulsiones de agua y aceite en forma de gotículas. Cada partición pasa por una amplificación de PCR punto final. Las particiones con y sin producto amplificado se cuentan de manera individual. Las que contienen producto amplificado y que muestran una señal fluorescente se designan como «positivo» y se les da una puntuación de 1. Las que no contienen producto amplificado y muestran solo señal de fondo se designan como «negativo» y reciben una puntuación de 0. A continuación, se aplica un análisis de estadística de Poisson para determinar la concentración absoluta de elementos diana presentes en la muestra inicial, sin que dependa de referencias o estándares.

La dPCR y su metodología de partición son la mejor opción en las aplicaciones que requieren la detección de pequeñas cantidades de ácido nucleico de inicio o una resolución muy precisa en las cantidades diana, como la detección de elementos poco frecuentes, el análisis de variación en el número de copias y el análisis de expresión génica de los transcritos en bajos niveles de abundancia. También será más apropiado recurrir a la óptima precisión y la alta sensibilidad de las dPCR respecto a las qPCR en el caso de aplicaciones como biopsia líquida, análisis de célula única, cuantificación de genoteca de NGS, cuantificación de cargas bacterianas y víricas bajas, análisis de eventos de edición genética y detección de OGM. Para la mayoría de los investigadores, la dPCR es un enfoque complementario a la qPCR.

Se puede usar una amplísima gama de material, por ejemplo: ADN genómico aislado de sangre, tejidos, células, tumores, cultivo celular, exudados, lavados, ADN de FFPE (muestras fijadas con formalina e impregnadas en parafina), ADNlc (ADN libre circulante), ADNtc (ADN tumoral circulante), ADN tratado con bisulfito, ADN ambiental, ADNc, ADN bacteriano, ADN vírico, ADN plasmídico, ADN de genotecas y ADN sintético, como gBlocks y cebadores oligonucleótidos largos, ARN total, microARN, ARNlnc, ARN vírico, ARN bacteriano y ARN transcrito en vidrio.

No, porque PCR digital es un término genérico para designar todos los métodos de PCR digital, no solamente la PCR digital en gotas (ddPCR). Por ejemplo, en la ddPCR se usan gotículas como divisiones para la muestra de PCR, mientras que otros métodos de PCR digital se basan en placas de microfluidos, chips de microfluidos u otros principios.

Esto depende de la definición de PCR convencional. La PCR en punto final depende de la electroforesis en gel para el análisis cualitativo o semicuantitativo de ácidos nucleicos. La PCR cuantitativa (qPCR) puede medir concentraciones de ácido nucleico en tiempo real basándose en curvas estándar. La PCR digital ofrece cuantificación absoluta de ácidos nucleicos al combinar la PCR punto final con las particiones y su estadístico.

Una técnica de PCR digital es un método de cuantificación absoluta de ácidos nucleicos. Las reacciones de PCR se dividen en miles de particiones, donde el ácido nucleico diana se amplifica individualmente. Las sondas o colorantes de fluorescencia se usan para detectar la presencia o la ausencia de productos en cada partición.

La diferencia entre PCR digital y PCR digital basada en gotas (ddPCR) es el método de división. En la dPCR basada en nanoplaca, la muestra se divide en miles de particiones dentro una placa de dPCR de microfluidos. En la PCR digital basada gotas (ddPCR), la muestra se divide en miles a millones de gotas, que luego se analizan una por una en un lector de gotas.

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