Ein Leitfaden zur dPCR für Anfänger – Finden Sie Tipps und Ressourcen für Ihr Labor und legen Sie los
Grundlagen der Nanoplatten-dPCR
Der QIAcuity Nanoplatten-dPCR-Workflow umfasst drei grundlegende Schritte: Pipettieren und Laden, Ausführen des Experiments und Analyse der Ergebnisse. Im Prinzip ist das Konzept der qPCR sehr ähnlich. Der entscheidende Unterschied liegt in dem Zugewinn an Präzision und Sensitivität bei Aufrechterhaltung der Kosten der Quantifizierung.
Schritt 1: Vorbereiten und laden
Im ersten Schritt ist es wichtig, Ihre Proben vorzubereiten. Wir empfehlen die Messung der DNA-Menge und -Reinheit. Abhängig von Ihrer Anwendung kann die Probe auch in verschiedenen Verdünnungen getestet werden. Die Verwendung reiner Proben ohne hohe Konzentrationen an PCR-Inhibitoren ist von Vorteil. Weitere Informationen zur Probenvorbereitung finden Sie imQIAcuityApplications Guide.
Erstellen Sie als Nächstes ein Experiment in der QIAcuity Software Suite. Dafür müssen Sie die dPCR-Parameter wie Priming-, Cycling- und Bildgebungsprofile, Reaktionsgemische, Proben und Kontrollen sowie das Plattenlayout definieren. Sobald die Platte definiert wurde, ist sie bereit für den Analyselauf. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch in einer Vorplatte vor, indem Sie den QIAcuity PCR Master Mix mit der Probe, den Primern, RNase-freiem Wasser und optional Restriktionsenzym versetzen. Das endgültige Reaktionsvolumen ist abhängig von der verwendeten QIAcuity Nanoplate. Das vorbereitete Reaktionsgemisch kann dann in die Nanoplatte pipettiert werden. Um Verdampfung und Kontamination der Nanoplatte zu vermeiden, ist sie ordnungsgemäß zu versiegeln. Zur Befestigung der Folie auf der Platten-Makrostruktur wird ein Roller verwendet. Die ordnungsgemäße Befestigung des Plattenversiegelung durch manuelles Rollen ist wichtig für ein gutes Füllergebnis. Die Platte muss an den Seitenkanten festgehalten oder im Tablett transportiert werden und ohne Wackeln oder Umdrehen zum QIAcuity gebracht werden, um sicherzustellen, dass das Reaktionsgemisch sich am Boden des Eingabe-Wells befindet. Wenn das Gerät und die Suite verbunden sind, sind alle Module einsatzbereit und die Platten können geladen und gestartet werden.
Schritt 2: Lauf durchführen und amplifizieren
Sobald die Platte geladen wurde, hebt das Gerät den Stellplatz in Blau hervor und liest den Barcode aus. Das im Voraus in der Steuerungssoftware eingestellte bevorzugte Experiment kann mit der Platte verknüpft, die Priming-, Cycling- und Bildgebungsprofile können definiert und der Lauf gestartet werden.
Zuerst wird die Platte im Priming-/Rollmodul bearbeitet. In diesem Schritt wird das Reaktionsgemisch in jedem Well auf Tausende kleiner Einzelreaktionen partitioniert. Dann wird in einem Thermocycler die PCR durchgeführt. Das in einigen Partitionen befindliche geeignete Template-Material führt zu einem positiven Fluoreszenzsignal, welches bei der Bildgebung detektiert wird. Die Aufnahmen werden zur Bildverarbeitung an die QIAcuity Software Suite gesendet.
Der aktuelle Plattenstatus kann entweder auf dem Gerätebildschirm oder in der Software Suite eingesehen werden.
Schritt 3: Ergebnisse auswerten
Wählen Sie zum Analysieren eine der folgenden Optionen aus: Absolute Quantifizierung, Mutationsnachweis, Genomediting, Kopienzahlvariation oder Genexpression. Für die absolute Quantifizierungsanalyse wählen Sie einfach die gewünschten Wells und entweder Target oder Detektionskanal aus. In der Listenansicht sind Konzentration, Konfidenzintervall sowie gültige positive und negative Partitionen aufgeführt. Eine Heatmap zeigt den Target-Kanal neben dem Referenzkanal. Um die Schwellenwert-Einstellungen zu ändern, wählen Sie entweder Histogramm, 1D-Scatterplot oder 2D-Scatterplot. Klicken Sie auf“recalculate”(erneut berechnen), um Ergebnisse basierend auf dem geänderten Schwellenwert zu erhalten.
Fehlerbehebung und Optimierung für die digitale PCR
